USE OF NATURAL ADDITIVES AS FEED SUPPLEMENTS TO REDUCE THE METHANE EMISSION FROM RUMINANTS

Since the ban of antibiotics as growth promoting feed additives by the European Union in 2006, plant extracts and plant secondary metabolites have been considered as an alternative to manipulate the rumen. The term ‘plant secondary metabolite’ is used to describe a vast array of chemical compounds in plants that are not involved in the biochemical processes of plant growth and reproduction. These have been studied and used in medicines and preservation of foods for a substantial time. The technology to assess methane emission in vivo is very slow, expensive, labour intensive and unsuitable for large-scale individual animal measurements. For this reason, a great deal of research has been conducted using in vitro simulation technique, which estimates the emission in vivo. However, the in vitro systems are often disapproved because of their short term duration (i.e. 24 hrs) and the lack of adaptation (they are conducted using rumen fluid which had not been exposed to the presence of the investigated compounds before). Based on this argument, this thesis aims to examine different aspects, regarding systems and procedures, used to investigate rumen fermentation and methane emission from ruminants, as follows: 1) Screening of different natural additives using a batch culture system; 2) Verify, through a batch culture system, the effect of the subministration in vivo of some natural additives in order to adapt the rumen fluid used as inoculum; 3) Asses the effect of one natural extract using a long-term continuous culture system; 4) Study the consequences on dairy products after the subministration of natural additives to lactating dairy cows. The first contribution aimed to explored effects of four pure plant extracts (allyl-sulfyde, cinnamaldehyde, eugenol, and limonene) and one synthetic compound (monensin), on in vitro rumen fermentation and methane (CH4) production of a commercial diet for dairy cows, using a batch culture system, equipped with devices for automated gas venting at fixed pressure. Two dosages were tested: 3 or 30 mg/g of diet for the plant extracts; 0.015 or 0.030 mg/g of diet for Monensin. All the additives were ineffective at the low dosage. The high dosage of limonene caused a marked depression of neutral detergent fiber degradability (NDFd) (-68%) and true dry matter degradability (TDMd) (-14%) compared to the control; less marked reductions were noted for high dosage of eugenol (-15% and -4%, for NDFd and TDMd, respectively) and of monensin (-16% and -3%, for NDFd and TDMd, respectively). No effects emerged for other additives on NDFd and TDMd, irrespective by the dosage. Compared to the control, high dosage of allyl sulfide, cinnamaldheyde, eugenol, limonene and monensin significantly reduced gas production (ml/g DM; -16%, -12%, -9%, -38%, -12%, respectively). In vitro CH4 production was significantly reduced only by high dosage of allyl sulfide, cinnamaldheyde, limonene and monensin (-32%, -12%, -43%, -18%, respectively, compared to the control). Only high dosage of allyl sulfide, and limonene significantly reduce CH4 proportion (-18%, -12% respectively, compared to the control). The most promising results were observed for the high dosage of cinnamaldehyde, that reduced in vitro CH4 production without compromising degradability and VFA production. Based on the results of the first trial, cinnamaldehyde, limonene and allyl-sulfide have been selected as the most effective in the reduction of methane emission, but also preserving the feed degradability and rumen functionality. The three compounds have been tested following a different procedure, indeed, the second trial aim was to evaluate the effect of rumen fluid which has not been adapted (NAF) and rumen fluid that has been adapted (AF) to the presence of the extract in vivo, before the in vitro tests. Therefore, four dry cows were fed diets with and without the pure compounds, according to a 4×4 Latin Square design, and the collected rumen fluids were used as in vitro inocula with or without the addition of the 3 compounds during the incubation. Cinnamaldehyde, limonene and allyl-sulfide have been tested for in vitro gas production kinetics and end products of fermentation. In general, the results confirmed the first additive performed, however, regarding the adaptation in vivo of the rumen fluid, the use of AF did not affect any fermentation parameter compared to NAF. However, adding an in vitro diet with allyl-sulfide, the magnitude of the effects of this pure compound tended to be greater when incubated with AF compared to NAF. These results suggest that the administration of pure compounds to the cows can affect the rumen microbial activity and the response of in vitro experiments. The third trial examined another category of plant secondary metabolites, flavonoids, which have recently gained interest because of their wide range of biological activities, but also because of their antimicrobial properties. Previously, it has been hypothesised that an extract of liquorice, rich in prenylated isoflavonoids and particularly glabridin, might potentially improve the efficiency of nitrogen utilisation and reduce methane production in the rumen. The experiment was carried out using a different in vitro system, the long-term rumen simulation technique (RuSimTec), which maintained the vitality and functionality of the rumen microbiome for long time and adapt the rumen fluid to the presence of the extract. The results obtained showed that when liquorice extract is added at 1 g/L, ammonia production decreased (-51%; P<0.001) without affecting the overall fermentation process. When added at 2 g/L, decreases in ammonia production (-77%; P<0.001), methane (-27%; P=0.039) and total VFA production (-15%; P=0.003) were observed. These effects in fermentation were probably related to decreases in protozoa numbers, a less diverse bacteria population as well as changes in the structure of both the bacterial and archaeal communities. The inclusion of an isoflavonoid-rich extract from liquorice in the diet may potentially improve the efficiency of the feed utilisation by ruminants. Many studies have investigated the use of the plant secondary metabolites in vitro, but very limited research have examined the consequences may derived from feeding dairy cows with the additives. In particular, the focus of the fourth contribution is the use of garlic and garlic second metabolite as feed additives, recently proposed as modulators to reduce the enteric methane emissions of ruminants. Since there is no evidence available, this study aimed to investigate the influence of garlic and allyl sulfide on dry matter intake (DMI), productive performances, milk coagulation properties, cheese yield, milk and cheese sensory profiles, and rheological characteristics. Four dairy cows were fed a total mixed ration either receiving 0 g/d (control) or supplemented with 100 or 400 g/d of garlic cloves or 2 g/d of Allyl sulfide in 4 consecutive experimental periods in a 4×4 Latin square design. Each experimental period consisted of 7 d of transition and 14 d of treatment. Milk samples were collected from each cow for chemical analysis and cheese-making. The organoleptic properties of the milk and 63 d ripened cheeses were assessed by a panel of 7 trained sensory evaluators. The experimental treatments had no effects on DMI, milk yield, feed efficiency (milk yield/DMI), milk coagulation properties, nutrient recovery and cheese yield. Garlic-like aroma, taste and flavour of milk and cheese were significantly influenced by the treatments, particularly the highest dose of garlic cloves, and we found close exponential relationships between milk and cheese for garlic-like aroma (R2 = 0.87) and garlic-like flavour (R2 =0.79). Allyl sulfide and 400 g/d of garlic cloves resulted in lower pH, shear force and shear work of ripened cheeses compared with the other treatments. Garlic cloves and Allyl sulfide had opposite effects on cheese colour indices. In conclusion, the addiction of 400 g/d of garlic to the feed of lactating dairy cows highly influences the sensory and rheological characteristics of cheese.

A causa del divieto di utilizzo di antibiotici come additivi alimentari promotori della crescita, da parte dell'Unione Europea nel 2006, gli estratti vegetali e i relativi metaboliti secondari sono stati considerati come una valida alternativa per la manipolazione dell’ambiente ruminale. Il termine "metabolita secondario" viene utilizzato per descrivere una vasta gamma di composti chimici vegetali che non sono coinvolti nei processi biochimici di crescita e riproduzione vegetali, ampiamente studiati ed utilizzati in medicina e nella conservazione degli alimenti. La tecnologia disponibili per misurare l'emissione di metano in vivo è molto costosa, lenta, laboriosa e non applicabile su vasta scala. Per questo motivo sono state condotte numerose ricerche usando tecniche di simulazione in vitro, che consentono di stimare l'emissione in vivo. Tuttavia i sistemi in vitro sono spesso criticati a causa della breve durata (24 ore, per esempio) e della mancanza di adattamento dell’ambiente ruminale al composto in esame. Sulla base di questi argomenti, i contributi della presente tesi hanno l’obiettivo di studiare le fermentazioni ruminali e l'emissione di metano aplicanto differente metodologicie sperimentali e differenti principi attivimetodologie per, come di seguito sintetizzato: 1) Screening di additivi naturali utilizzando un sistema batch culture; 2) Verificare, attraverso un sistema batch culture, l'effetto della somministrazione in vivo di alcuni additivi naturali allo scopo di adattare il liquido ruminale utilizzato come inoculo; 3) Misura l'effetto di un estratto naturale utilizzando un sistema continuo a lungo termine; 4) Studiare le conseguenze sui prodotti lattiero-caseari della somministrazione di additivi naturali a vacche da latte. Nel primo contributo si è voluto esaminare gli effetti di quattro estratti vegetali puri (sulfuro di allile, cinnamaldeide, eugenolo e limonene) ed un composto sintetico (monensin), sulle fermentazioni ruminali e la produzione di metano enterico di una dieta standard per vacche da latte. Il sistema utilizzato (batch culture) è dotato di valvole per il rilascio automatica del gas di fermentazione a pressione fissa ed è equipaggiato con un sistema wireless di trasmissione in continuo dei dati misurati. I dosaggi testati sono stati 2: 3 e 30 mg/g di dieta incubata, per ogni estratti vegetali, e 0.015 o 0.030 mg/g di dieta nel caso del Monensin. I risultati della prova hanno evidenziato una generale inefficacia di tutti gli estratti a basso dosaggio. Tuttavia l'elevato dosaggio del limonene ha causato una marcata riduzione della degradabilità della fibra NDF (NDFd) (-68%) e della degradabilità della sostanza secca (TDMd) (-14%) rispetto al controllo. anche l'alto dosaggio di eugenolo (-15% e -4%, per NDFd e TDMd rispettivamente) e del monensin (-16% e -3% rispettivamente per NDFd e TDMd) hanno ridotto la degradabilità della dieta ma tali effetti sono stati più contenuti. Non sono emersi effetti significativi nel caso degli altri additivi su NDFd e TDMd, indipendentemente dal dosaggio. Rispetto al controllo, l'elevato dosaggio di sulfuro di allile, cinnamaldeide, eugenolo, limonene e monensin ha significativamente ridotto anche la produzione di gas (ml/g DM, -16%, -12%, -9 %, -38%, -12% rispettivamente) mentre la produzione di CH4 in vitro è stata significativamente ridotta solo da alti dosaggi di sulfuro di allile, cinnamaldeide, limonene e monensin (-32%, -12%, -43%, -18%, rispettivamente, confrontati con al controllo). Solo l'elevato dosaggio di sulfuro di allile e limonene riduce significativamente la percentuale di CH4 nei gas di fermentazione (-18% e -12%, rispettivamente, rispetto al controllo). I risultati più promettenti sono stati osservati per l'alto dosaggio di cinnamaldehide, che ha ridotto la produzione di CH4 in vitro senza compromettere la digeribilità della dieta e la produzione di acidi grassi volatili. Sulla base dei risultati del primo contributo stati selezionati tre additivi considerati più efficaci nella riduzione dell'emissione di metano, ma preservando la degradabilità della dieta e la funzionalità dell’ambiente ruminale: cinnamaldeide, limonene e sulfuro di allile. Nel secondo contributo gli additivi sono stati sottoposti a test in vitro (batch culture) in seguito ad una fase precedente di adattamento. L’obiettivo è stato di valutare l'effetto del liquido ruminante che non è stato adattato (NAF) e del liquido ruminale adattato (AF) alla presenza dell'estratto in vivo, prima di essere utilizzato come inocula microbico nel test in vitro. La prova ha previsto l’uso di quattro vacche in asciutta alimentate con dieta di riferimento per vacche da latte, addizionata dei composti puri, seguendo uno schema sperimentale a quadrato latino 4x4. I liquidi ruminali raccolti sono stati utilizzati come inoculo con o senza l'aggiunta dei 3 composti anche in sede di incubazione. Gli estratti sono stati testati per la cinetica di produzione di gas in vitro ed i prodotti di fermentazione. In generale, l’effetto dei diversi additivi sulle fermentazioni ruminali hanno confermato la prova di screeningprecedentemente realizzata. Per quanto riguarda l'adattamento in vivo del liquido ruminale, l'uso di AF non ha influenzato alcun parametro di fermentazione rispetto al NAF ma, aggiungendo il sulfuro di allile in sede di incubazione, la portata degli effetti di questo composto è stato maggiore quando incubato con AF rispetto a NAF. Questi risultati suggeriscono che la somministrazione di composti puri a vacche può influenzare l'attività della microflora ruminale e quindi la risposta di esperimenti condotti in vitro. Nel terzo contributo si è voluto categoria di metaboliti secondari, i flavonoidi, che sono stati recentemente oggetto di interesse per la loro vasta gamma di attività biologiche, ma anche per le loro proprietà antimicrobiche. è stato ipotizzato che un estratto di liquirizia, ricco di isoflavonoidi prenilati ed in particolare glabridina, potrebbe potenzialmente migliorare l'efficienza dell'utilizzo dell'azoto e diminuire la produzione di metano ruminale. L'esperimento è stato condotto utilizzando la tecnica di simulazione a lungo termine (RuSiTec), che consente di mantenere per lungo tempo la vitalità e la funzionalità del microbioma ruminale e adattare il liquido alla presenza dell'estratto, a differenza del sistema batch culture. L’estratto è stato testato in due dosaggi: 1 g/L e 2 g/L. I risultati ottenuti hanno evidenziato che la dose di 1 g/L ha ridotto la produzione di ammoniaca (-51%, P <0,001) senza influenzare il processo di fermentazione complessivo. Quando invece sono stati aggiunti 2 g/L, non solo la produzione di ammoniaca è diminuita (-77%; P <0.001), ma anche la produzione di metano (-27%, P = 0.039) e la produzione totale di VFA (-15%; P = 0.003). Questi effetti in fermentazione sono probabilmente correlati ad una diminuzioni del numero di protozoi e ad una modificazione nella struttura della comunità battericha e degli arcaea con riduzione della biodiversità. In conclusione quindi, l'inclusione di un estratto di liquirizia, ricco di isoflavonoidi nella dieta, può potenzialmente migliorare l'efficienza dell'utilizzo della dieta da parte dei ruminanti, sulla base degli effetti verificati in vitro. L’utilizzo di metaboliti secondari come additivi alimentari per vacche in produzione comporta necessariamente il possibile passaggio nel latte di sostanze che possono modificare la qualità dei prodotti lattiero-caseari. A questo proposito, la letteratura risulta molto limitata, e dal momento che non ci sono prove disponibili, l’obiettivo del quarto contributo è stato verificare come l'uso di aglio e sulfuro di allile, recentemente proposti come modulatori delle emissioni di metano enterico, influenzino i prodotti lattiero-caseari. L’effetto è stato verificato sull’ingestione di sostanza secca, le prestazioni produttive, le proprietà di coagulazione del latte, la resa casearia del formaggio, il profilo sensoriale di latte e formaggio e le caratteristiche reologiche di quest’ultimo. Quattro vacche in lattazione sono state alimentate con una dieta di riferimento senza la presenza di additivi (controllo) o integrata con 2 dosi crescenti di aglio, 100 o 400 g/d, o con 2 g/d di sulfuro di allile, in 4 periodi sperimentali consecutivi secondo uno schema a quadrato latino 4×4. Ogni periodo sperimentale era costituito da 7 d di transizione e 14 d di trattamento. Il latte è stato campionato per l'analisi chimica e la caseificazione. Le proprietà organolettiche del latte e dei formaggi, dopo stagionatura di 63 giorni, sono state valutate da un gruppo di 7 valutatori addestrati. I trattamenti sperimentali non hanno avuto effetti sull’ingestione alimentare, sulla produzione di latte, sull'efficienza alimentare, sulle proprietà coagulative del latte, sul recupero dei nutrienti e sulla resa casearia. L'aroma ed il sapore del latte e del formaggio sono stati particolarmente influenzati dai trattamenti sperimentali, in particolare dalla dose più alta di spicchi d'aglio. I risultati hanno evidenziato un’elevata correlazione tra latte e formaggio per quanto riguarda l'aroma di aglio (R2 = 0,87) ed il flavor di aglio (R2 = 0,79). Il sulfuro di allile e la dose più alta di spicchi d'aglio (400g/d) hanno provocato una riduzione del pH, dello sforzo di taglio ed il corrispondente lavoro di taglio dei formaggi stagionati. L’agli in spicchi ed il sulfuro di allile hanno mostrato effetti opposti sugli indici colorimetrici del formaggio stagionato. In conclusione, l’integrazione di 400 g/d di aglio in diete per vacche in lattazione influenza notevolmente le caratteristiche sensoriali e reologiche del formaggio.