Development of analytical methods for the characterization of genetic polymorphism linked to β-casein alleles and their influence on milk quality and processability in the dairy industry

β-casein (β-CN) is one of the major protein fractions and accounts for approximately 37% of total caseins. β-CN is coded by the CSN2 gene and is found in different genetic variants. Specifically, A1 and A2 are the most common variants and differ in a single amino acid residue at position 67 of the amino acid chain. Such mutation causes structural differences in the resulting protein, having diverging influence on milk quality. For this reason, these variants become one of the predominant topics of current research and debate within the scientific community and the dairy sector. The debate is driven by the consumption of the β-casein A1 variant which, compared to the A2 variant, has a potential negative impact on human health but, at the same time, its presence improves milk technological properties. With such background, the aims of the PhD thesis were to i) evaluate reliable services, helpful to farmers, for large-scale screening studies on individual β-casein genetic characterization; ii) assess whether the use of different preservatives and storage procedures have an influence on milk protein profile through high-performance liquid chromatography (HPLC); iii) quantitatively investigate the effects the proportional amounts of β-CN variants (A1, A2 and B), as determined via HPLC, have on bulk milk composition and technological properties; iv) evaluate the potential implications the relative content of β-CN A2 and A1 may have on detailed protein composition and cheese-making traits in field conditions. In the 1st chapter, two allele-specific PCR procedures, namely restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR) and amplification refractory mutation system (ARMS-PCR), and one biochemical technique, HPLC, were evaluated and validated through sequencing. Manual and automated DNA extraction protocols from milk somatic cells were also compared. Overall, automated extraction of DNA from milk matrix combined with ARMS-PCR is the most suitable technique to provide genetic characterization of the CSN2 gene on large-scale. The 2nd chapter provides an insight into the effect of sampling procedure and storage conditions on detailed protein characterization through HPLC. Three preservatives (hydrogen peroxide, Bronopol, and Azidiol) and three durations of freezing (0, 7, and 30 d), were tested. Bronopol was associated with the lowest concentrations of protein fractions while increased freezing time had a detrimental effect on milk protein composition. According to z-scores and from a practical point of view, short storage time under freezing conditions is preferable to obtain reliable results. The 3rd chapter represents a first contribution to the quantitative investigation into the effect of β-casein variants on traditional milk quality traits, major minerals, milk coagulation properties, composition, and technological traits of bulk milk. Results demonstrated that greater concentration of β-CN B is linked with greater protein, casein, and fat content. Likewise, greater concentration of variants A1 and B of β-casein had a significant positive effect on rennet coagulation time and curd firmness, and was linked to a greater amount of Ca and P content compared to A2 variant. The 4th chapter investigates the relationships between the genetic polymorphisms and cheese-making traits at dairy plant level. 5 milk pools diverging for presence of β-CN A1 and A2 variants were obtained and cheese yield, curd nutrient recovery, whey composition, and cheese composition were assessed. Overall, an increase in the proportion of β-CN A2 in bulk milk negatively affected protein fractions, nutrient recovery, and cheese yield. However, no differences in the final cheese composition were observed.

La β-caseina (β-CN) è una delle principali frazioni proteiche e rappresenta circa il 37% delle caseine totali; è codificata dal gene CSN2 e presenta diverse varianti genetiche. In particolare, le varianti A1 e A2 sono le più comuni e differiscono per un singolo aminoacido in posizione 67 della catena aminoacidica. Tale mutazione provoca differenze strutturali nella proteina risultante, le quali influenzano in modo diverso la qualità del latte. Per questo motivo, le varianti A1 e A2 della β-CN sono diventate uno dei temi principali nel dibattito attuale all'interno della comunità scientifica e del settore lattiero-caseario. In particolare, il dibattito si concentra sul consumo della variante A1 della β-CN che, rispetto alla variante A2, sembra avere un potenziale impatto negativo sulla salute umana ma, allo stesso tempo, la sua presenza migliora le proprietà tecnologiche del latte. Con queste premesse, gli obiettivi della presente tesi sono: i) valutare servizi affidabili e utili agli allevatori per studi di screening su larga scala per la caratterizzazione genetica della β-CN; ii) valutare se l'uso di diverse procedure di conservazione hanno un'influenza sul profilo proteico del latte determinato attraverso cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC); iii) indagare quantitativamente gli effetti che la proporzione delle diverse varianti di β-CN (A1, A2 e B) ha sulla composizione e sulle proprietà coagulative del latte di massa; iv) valutare le potenziali implicazioni che il contenuto relativo di β-CN A2 e A1 può avere sul profilo proteico e sui parametri di caseificazione. Nel primo capitolo, sono state valutate due procedure di PCR allele-specifiche, ovvero il polimorfismo da lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP-PCR) e il sistema di mutazione refrattario all’amplificazione (ARMS-PCR) e una tecnica biochimica, l'HPLC. Sono stati inoltre confrontati i protocolli di estrazione manuale e automatico del DNA dalle cellule somatiche del latte. Nel complesso, l'estrazione automatica del DNA combinata con l'ARMS-PCR è la tecnica più adatta per fornire una caratterizzazione genetica del gene CSN2 su larga scala. Il secondo capitolo illustra l'effetto che le condizioni di conservazione hanno sulla determinazione del profilo proteico mediante HPLC. Sono stati testati tre conservanti (perossido di idrogeno, Bronopol e Azidiol) e tre tempi di congelamento (0, 7 e 30 giorni). Il Bronopol e l’aumento del tempo di congelamento sono stati associati alle concentrazioni più basse di frazioni proteiche. In base allo Z-score e da un punto di vista pratico, è preferibile un breve tempo di conservazione in condizioni di congelamento per ottenere risultati affidabili. Il terzo capitolo rappresenta un primo contributo sull’effetto quantitativo delle varianti della β-CN sulla composizione tradizionale e minerale e sulle proprietà coagulative del latte di massa. I risultati hanno dimostrato che una maggiore concentrazione di β-CN B è associata a un maggiore contenuto di proteine totali, caseine e grasso. Allo stesso modo, una maggiore concentrazione delle varianti A1 e B ha un significativo effetto positivo sul tempo di coagulazione e sulla consistenza del coagulo, ed è stata associata a un maggiore contenuto di Ca e P rispetto alla variante A2. Il quarto capitolo analizza le relazioni tra i polimorfismi genetici e i parametri di caseificazione attraverso caseificazioni sperimentali. Sono stati ottenuti 5 pool di latte che divergono per la presenza delle varianti β-CN A1 e A2 ed è stata valutata la resa casearia, il recupero dei nutrienti della cagliata, la composizione del siero e la composizione del formaggio. In generale, un aumento della percentuale di β-CN A2 nel latte di massa ha influito negativamente sulle frazioni proteiche, sul recupero dei nutrienti e sulla resa casearia. Tuttavia, non sono state osservate differenze nella composizione finale del formaggio.