Setting up of molecular tools for studying abscission in apple (Malus x domestica)

Abscission is a natural self-regulatory mechanism whereby fruit trees shed part of the fruitlets, and is an important agricultural event from the farmer’s point of view because it directly affects the final size and quality of the commodity. In spite of this self-regulatory mechanism, fruit trees set too many fruitlets negatively affecting not only the final quality, but also the returning bloom. To avoid these effects, farmers perform blossom or fruitlet thinning to adjust crop load and ensure a satisfactory fruit quality at harvest for commercial purposes. Chemical thinning is nowadays a common orchard practice in some apple cultivars but its effects on fruit trees depend on environmental factors and genotypes. A widely employed chemical thinner, the carbaryl (Sevin), has been withdrawn from the market and replaced with benzyladenine (BA), a cytokinin that has a milder effect both on the tree and human health. At molecular level, abscission is a coordinated event under the control of auxin and ethylene. Both hormones play their role at the abscission zone (AZ) level. Auxin flux through the AZ target cell layers inhibits the onset of shedding whereas ethylene causes the up-regulation of degrading cell wall enzymes causing the cell separation and the fruitlet shedding. Nevertheless, no information is available about the signalling that causes the decreasing auxin flow and the gain in ethylene sensitivity in AZ. In Arabidopsis thaliana, the isolation of mutants with defects in floral organ abscission allowed the identification and characterization of genes involved in AZ differentiation and/or the signalling pathways. A model has been proposed by characterizing genes encoding receptors and ligands involved in the transfer of the shedding signal. In apple, a model to explain the fruitlet physiological drop is still missing as well as the isolation and characterization of genes involved in abscission. Although most of the researchers focused their attention mainly on the effect of chemicals on fruit quality and returning bloom, few of them considered also the dynamics of the transcriptomic changes occurring as consequence of the abscission induction. A working hypothesis taking into account the carbohydrate status within the fruitlet population and between fruitlets and shoots has been proposed. The recent development of massive gene approaches, based on microarray technologies, allowed to deeply investigate many fundamental biological process from a transcriptomic point of view. A recent work carried out in tomato investigated the genes involved in auxin homeostasis, as a consequence of IAA depletion during flower abscission induction. The model proposed represents a powerful platform for further analyzing the putative regulatory abscission-related genes involved in the gaining of ethylene sensitivity of the AZ. In the present dissertation, two different approaches have been adopted to investigate the early phases of apple fruitlet abscission: 1) A transcriptomic approach to isolate genes involved in the early steps of abscission, and 2) the characterization of volatile organic compounds (VOCs) emitted during abscission induction. 1) Apple fruitlet abscission was induced using BA as thinner. Fruitlets differing in size and position within the cluster were collected over a 4-day time-course, after BA treatment, and their gene expression profiles were analyzed, separately in cortex and seeds, by means of a newly released 30K oligonucleotide microarray. The analysis of the transcriptomic profiles of abscising and non-abscising fruitlets was tested for statistical association with abscission potential to identify molecular signatures strictly related to fruit destiny. Reactive oxygen species (ROS) and carbohydrates (glucose, fructose, sucrose, sorbitol, and starch) were also measured. A hypothetical model for apple fruitlet abscission was obtained by putting together available transcriptomic and metabolomic data. According to this model, BA treatment would establish a nutritional stress within the tree that is primarily perceived by the fruitlet cortex whose growth is blocked by resembling the ovary growth inhibition found in other species. In weaker fruits, this stress is soon visible also at the seed level, likely transduced via ROS/sugar and hormones signalling crosstalks, and followed by a block of embryogenesis and the consequent activation of the abscission zone. 2) Fruitlets of two cultivars (Golden Delicious and Red Chief) with different abscission potentials treated with two different thinning agents (BA and metamitron) were analyzed by means of proton transfer reaction mass spectrometer (PTR-MS) over a 10-day time-course looking for volatile organic compounds (VOCs) differentially emitted. Results pointed out that isoprene is more abundantly emitted by the abscising fruitlets in both cultivars. A relationship between isoprene emission and ABA content in the fruit cortex was also pointed out, along with a specific activation of the corresponding biosynthetic genes. A delayed transcriptional activation of a biosynthetic gene involved in a key step of methyl-erythritol phosphate (MEP) pathway, supplying the precursors for both isoprene and ABA biosynthesis, was also shown. According to the main findings, a role for isoprene as a ROS-detoxifying mechanism mediated and transcriptionally controlled by ABA may be hypothesized. Future perspectives will be focused on all the research lines herein adopted. The biological function of the genes identified by means of the transcriptomic approach will be studied at the cellular level, with in situ hybridization, and their expression pattern further validated. Attention will be focused in particular on transcription factors and other regulatory elements involved in hormonal cross-talk. The abscission-related VOCs (i.e. isoprene) will be validated to assess the possible applications in fruit load prediction systems, in order to fine-tune the use of thinning chemicals according to a more-environment-friendly agriculture.

L'abscissione è un meccanismo auto-regolativo per cui gli alberi da frutto rilasciano naturalmente parte dei frutticini ed è un evento agronomico importante dal punto di vista del produttore perché incide sulla qualità del raccolto a maturazione. Nonostante questo meccanismo auto-regolativo, gli alberi da frutto trattengono troppi frutticini, influendo negativamente non solo sulla dimensione e la qualità finale dei frutti, ma anche sulla fioritura nell’anno successivo. Per evitare questi effetti negativi, i coltivatori utilizzano comunemente diradanti chimici che agiscono su fiori o frutticini, allo scopo di regolare il carico iniziale ed ottenere così una qualità della frutta corrispondente alle esigenze di mercato. In melo il diradamento chimico è una pratica comune la cui efficacia sugli alberi da frutto è dipendente, purtroppo, da fattori ambientali e dai diversi genotipi. Un diradante chimico ampiamente utilizzato, il carbaryl (Sevin), è stato ritirato dal mercato e parzialmente sostituito con la benziladenina (BA), una citochinina che ha un effetto più contenuto sull'albero e sulla salute umana. A livello molecolare, l'abscissione è un processo coordinato principalmente dall'auxina e dall'etilene. Entrambi questi ormoni svolgono il loro ruolo a livello della zona di abscissione (AZ). Il flusso continuo dell'auxina attraverso la AZ inibisce il processo di abscissione, mentre l'etilene induce una regolazione positiva degli enzimi degradanti la parete cellulare provocando la separazione delle cellule della AZ e la caduta dei frutticini. Le informazioni riguardanti il segnale che causa la diminuzione del flusso di auxina e l'aumento nella sensibilità all'etilene nella AZ sono tuttavia ancora parziali e piuttosto carenti. In Arabidopsis thaliana l'isolamento di mutanti con difetti nel processo di abscissione dei fiori ha permesso l'individuazione di geni coinvolti o nel processo di differenziazione della AZ o nella via di trasduzione del segnale. Per quanto riguarda la cascola fisiologica dei frutticini in melo, le informazioni riguardanti il segnale che genera l’evento abscissione sono tuttora carenti e le collezioni di geni legati a tale fenomeno sono ancora molto parziali. La maggior parte delle ricerche, infatti, si è concentrata principalmente sullo studio dell’effetto di prodotti chimici sulla qualità della frutta e sulla fioritura, mentre solamente pochi studi hanno considerato la dinamica dei cambiamenti trascrizionali conseguente all'induzione dell’abscissione. Sulla base dei dati disponibili, è stata proposta l’ipotesi che considera lo stato nutrizionale all’interno della popolazione di frutticini e fra i fruitticini ed i germogli vegetativi come segnale necessario per l’attivazione dell’abscissione. Recentemente, lo sviluppo di approcci trascrittomici di carattere massale, basato sulle tecnologie microarray, ha consentito di studiare in maniera più approfondita questo processo biologico. Un recente studio effettuato in pomodoro ha permesso di studiare geni coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi dell'auxina a livello di AZ in seguito ad una diminuzione del flusso della stessa durante l'induzione dell’abscissione nel fiore. Il modello proposto rappresenta un punto di partenza molto rilevante per identificare altri geni coinvolti nella regolazione dell’abscissione e nella sensibilizzazione dell’AZ all'etilene. In questa tesi sono stati impiegati due differenti approcci per studiare l’abscissione in melo: 1) Un approccio massale trascrittomico per isolare i geni strettamente coinvolti nelle prime fasi induttive dell’abscissione e 2) lo studio di composti organici volatili (VOCs) emessi durante l’induzione dell’abscissione. 1) L'abscissione di frutticini di melo è stata indotta usando la BA come agente diradante. Frutticini differenti per dimensione e posizione all'interno del corimbo sono stati raccolti entro i quattro giorni dal trattamento. L'espressione genica è stata analizzata per mezzo di un vetrino 30K recentemente sviluppato. L'analisi dei profili trascrizionali dei frutticini cascolanti e non cascolanti è stata esaminata allo scopo di identificare marcatori molecolari associati al destino del frutto. Il livello di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e di alcuni carboidrati (glucosio, fruttosio, saccarosio, sorbitolo e amido) è stato misurato nella cortex degli stessi campioni. Un modello ipotetico per l’abscissione di frutticini di melo è stato ottenuto unendo i dati trascrittomici e metabolomici disponibili. Secondo questo modello, il trattamento con la BA amplificherebbe lo stress nutrizionale già in atto all'interno dell'albero, il quale viene percepito soprattutto dalla cortex di frutticini il cui sviluppo viene quindi bloccato. Nei frutti più deboli, questo stress viene quindi percepito a livello del seme. La traduzione di questo stress avviene probabilmente attraverso il crosstalk tra ROS, zuccheri e ormoni ed è seguito da un blocco dell'embriogenesi e dall'attivazione della AZ. 2) Frutticini di due diverse cultivar (Golden Delicious e Red Chief) con differente potenziale di abscissione trattati con due differenti diradanti chimici (BA e metamitron) sono stati analizzati per mezzo del PTR-MS (proton transfer reaction mass-spectrometer), entro i dieci giorni dal trattamento, allo scopo di identificare composti organici volatili (VOCs) associati all’abscissione. I risultati hanno evidenziato che i frutticini con potenziale di abscissione maggiore in entrambe le cultivar emettono più isoprene rispetto ai frutti persistenti. E’ stata inoltre evidenziata una correlazione significativa tra emissioni di isoprene e contenuto di ABA della cortex, parallelamente all’attivazione specifica dei rispettivi geni biosintetici. Successivamente avviene l’attivazione ritardata dei geni coinvolti nei passaggi chiave della via del metileritritolo fosfato (MEP), che fornisce i precursori per la biosintesi sia del volatile che dell’ormone. Secondo questi risultati, si può ipotizzare per l’isoprene un ruolo di detossificatore di ROS, la cui attivazione è mediata e controllata a livello trascrizionale dall’ABA. Le prospettive future di questa ricerca saranno focalizzate su tutte le linee di ricerca finora perseguite. La funzione biologica dei geni identificati tramite l’approccio trascrittomico sarà ulteriormente studiata a livello cellulare, tramite ibridazioni in situ, e i loro profili di espressione genica saranno ulteriormente validati. Particolare attenzione sarà prestata ai fattori di trascrizione e agli altri elementi regolativi coinvolti nel cross-talk ormonale. Per quanto attiene i composti volatili (isoprene) saranno validati i risultati finora ottenuti allo scopo di verificare possibili applicazioni pratiche in sistemi previsionali che consentano di predire il livello di carica fruttifera e, quindi, di dosare i trattamenti diradanti nell’ottica di un’agricoltura sostenibile.