L'orologio circadiano di Drosophila melanogaster in condizioni naturali e in regimi artificiali perturbati

Defining the circadian clock of Drosophila melanogaster in natural and shift-work regimes The Drosophila clock is based on a system of interconnected feedback loops where some positive elements (the proteins CLOCK (CLK) and CYCLE (CYC)) induce the synthesis of the negative elements (the proteins PERIOD (PER) and TIMELESS (TIM)) which in turn inhibit the action of the positive ones in a 24 hour cycle (Zordan et al., 2003). These loops are controlled by post transcriptional and translational regulation. The clock is mostly resetted by external stimuli, like light and temperature (Zeitgeber) (Lin et al 2001; Dunlap, 1999). Different per and tim transcripts have been reported to be regulated by temperature. For per a termal sensitive splicing of 89 bases in the 3’ UTR (Untranslated region) of the mRNA generates the perunspliced and the perspliced mRNA. The splicing induces an earlier evening activity at cold temperature (Collins et al., 2004; Majercak et al., 2004). A termal sensitive splicing in tim originates two transcripts: timnornal and timcold. In timcold the last intron of 858 bases is not removed via splicing at cold temperature (Boothroyd et al., 2007). Till now all the previous studies concerning the circadian clocks have been carried out in laboratory, which cannot reflect the complexity of the stimuli that are present in the natural environment. This work provides new insights at behavioural and molecular level about circadian clocks in natural regimes. The observations carried in natural conditions highlighted that a number of established findings from the laboratory may not be relevant in the wild, and that natural conditions appear to compensate for many of the defects observed in the laboratory in clock mutants (per01, tim01, tim03 , per01; tim01, perS, perL, clkjerk, Pdf01, cry0), revealing a surprising independence of rhythmic behaviour from core clock genes. All clock genotypes can show morning (M) and evening (E) peaks, and starting at moderate temperatures, they show an additional peak, called afternoon ‘anti-siesta’. The M component appears to be mostly a temperature-dependent response to dim light levels during the twilights. The evening activity is related to the photoperiod. The E component appear more modulated by the clock: many clock mutants show evening anticipation revealing the effects of a residual clock programme or at least the capability to activate a physiological response. Moreover, from the analysis of the transcriptional profiles of per and tim in natural conditions it has been observed that the proportion of the perspliced and timcold mRNA increases as the temperature decreases. D. melanogaster is also considered a good model to study sleep. Sleep in mammals is a phenomenon depending on the interaction between the homeostatic and the circadian systems. A sleep-like state characterized by posture, behavioural quiescence and elevated stimulation threshold, all characters which are used to define the sleep state in mammals, has been identified in Drosophila (Hendricks et al., 2000; Shaw et al., 2000). Recent studies have pointed out the deleterious effects generated by the disturbance of sleep and circadian clock on the health of shift-workers (Cho, 2001; Knutsson, 2003; Esquirol et al., 2009; Puttonen et al., 2010). To investigate the effects of a chronic impairment of sleep, at behavioural and molecular level, we used Drosophila as a model. To this purpose different shift-work regimes were superimposed to a fly population by means of a “shift-work machine” in which the “working activity” consists in maintaining the equilibrium contrasting continuous mechanical shocks. The effects of the shift-work regimes were studied by monitoring locomotor activity, mortality, anatomical and behavioural traits in controls and in shift-workers. The overall results show behavioural and anatomical effects induced by the shift-work. On the basis of these findings it can be suggest that Drosophila should be considered as a useful model to investigate on the effects of chronic perturbations of the endogenous clock.

L’orologio circadiano di Drosophila melanogaster in condizioni naturali e in regimi artificiali perturbati L’orologio circadiano di Drosophila melanogaster è basato su un sistema di loop molecolari interconnessi dove elementi “positivi” (le proteine CLOCK (CLK) e CYCLE (CYC)) inducono la trascrizione di elementi “negativi” (le proteine PERIOD (PER) e TIMELESS (TIM)) che a loro volta sono in grado di inibire la loro stessa trascrizione generando un periodo di circa 24 ore (Zordan et al., 2003). Questi loop circadiani sono regolati sia a livello trascrizionale che traduzionale e possono interagire con l’ambiente ricevendo stimoli luminosi e termici (Zeitgeber) in grado di sincronizzare l’orologio con i ritmi ambientali esterni (Lin et al 2001; Dunlap, 1999). I geni period e timeless originano diverse varianti di splicing dell’mRNA. Lo splicing temperatura sensibile di un introne di 89 paia di basi nella regione 3’ UTR (Untranslated region) del gene period determina la formazione di due tipi di mRNA: perunspliced e perspliced. La forma perspliced è prevalente a basse temperature e si accumula più rapidamente rispetto alla forma perunspliced, accelerando tutto il meccanismo molecolare circadiano. In conseguenza di ciò in condizioni di laboratorio (LD12:12) a basse temperature (18°C) la fase dell’attività locomotoria serale delle mosche è anticipata (Collins et al., 2004; Majercak et al., 2004). Anche per il gene timeless sono state individuate due varianti di splicing dell’mRNA: timnornal e timcold. Nella variante timcold viene ritenuto, a basse temperature, l’ultimo introne di 858 paia di basi. Anche in questo caso si tratta di uno splicing temperatura regolato (Boothroyd et al., 2007). Finora l’orologio circadiano è stato studiato in condizioni di laboratorio, condizioni che non riflettono la complessità e la variabilità degli stimoli presenti nell’ambiente esterno. Questo lavoro di tesi ha affrontato per la prima volta lo studio dell’orologio endogeno circadiano di Drosophila melanogaster in condizioni naturali mediante un’analisi a livello comportamentale e molecolare. Le osservazioni condotte hanno mostrato come il modello dell’orologio circadiano definito dagli esperimenti di laboratorio sia difficilmente applicabile in condizioni naturali e come molti aspetti dell’attività locomotoria, un fenotipo controllato dall’orologio endogeno, benché osservati in condizioni di laboratorio nelle linee mutanti per i principali geni orologio siano assenti in natura. Molti dei genotipi mutanti analizzati (per01, tim01, tim03, per01tim01, perS, perL, clkjerk, Pdf01, cry0) si sono dimostrati ritmici in condizioni naturali con una chiara attività mattutina e serale. La componente mattutina del comportamento è risultata essere, in condizioni naturali, una risposta regolata dal variare dei parametri ambientali esterni (luce e temperatura), mentre l’attività serale è apparsa maggiormente controllata dall’orologio endogeno. A livello molecolare è stato osservato un andamento ciclico dell’espressione dei geni period e timeless in condizioni naturali e la proporzione delle diverse varianti di splicing della trascrizione dei due geni sul totale dell’mRNA espresso è risultata temperatura dipendente sia in condizioni di laboratorio che in natura. D. melanogaster è anche un ottimo modello per lo studio del sonno e dei suoi disturbi. Il sonno nei mammiferi è il risultato dell’interazione tra un processo omeostatico e uno circadiano. Tutte le caratteristiche proprie del sonno come la postura, la diminuzione del livello di attenzione e l’insorgere di una soglia di risveglio sono state riconosciute e ridefinite nelle mosche (Hendricks et al., 2000; Shaw et al., 2000). Studi recenti hanno inoltre dimostrato come la deregolazione cronica del sonno si traduca in conseguenze negative per la salute aumentando il rischio di cancro e di molte malattie legate al sonno (Cho, 2001; Knutsson, 2003; Esquirol et al., 2009; Puttonen et al., 2010). La seconda parte del mio lavoro di tesi ha cercato di definire un modello per applicare e studiare gli effetti della turnazione nel lavoro (shift-work cronico) nelle mosche. E’ stata costruita un’apparecchiatura per mimare con le mosche regimi artificiali di shift-work. Le analisi condotte hanno mostrato che lo shift-work cronico nelle mosche produce effetti negativi sulla sopravvivenza e su alcuni fenotipi comportamentali associati alla percezione visiva del movimento. Nel loro insieme i risultati ottenuti hanno dimostrato come Drosophila possa essere considerata un buon modello per questo tipo di studi.