nutrient dependent control of mitochondrial Ca2+ signaling

Eukaryotic cells are able to continuously adapt to fluctuations in external conditions. Furthermore, when metabolites availability varies, cells undergo rapid changes in order to adapt their metabolism and protect themselves against potential damages. These rapid changes are regulated through different nutrient dependent pathways. The most important proteins, known so far, involved in these pathways are AMPK and Sirtuins. These proteins, that have a key role in the cells response to caloric stress, are activated when the cells are under nutrient deprivation (Dilova et al. 2007). Ca2+ is a fundamental second messenger that enters the cytosol upon the opening of a variety of plasma membrane and endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) channels and controls numerous cell functions also at the mitochondrial site (Rizzuto and Pozzan 2006). Foskett’group recently identified a new role of constitutive Ca2+ transfer from ER to mitochondria. They demonstrated that this represents a crucial intracellular signal for AMPK activation and autophagy induction. On the other hand still unknown are the precise physiological signals inside the cell that can translate fluctuation of metabolites concentration into a specific regulation of mitochondrial Ca2+ content (Cardenas et al. 2010). During my PhD, I measured mitochondrial Ca2+ uptake using targeted recombinant aequorin (Pinton et al. 2007). I found that in HeLa cells, after 2 hours of glucose deprivation, mitochondrial Ca2+ uptake is drastically reduced. This physiological response appears to be transient and reversible. Indeed, after glucose deprivation, cells show a reduced mitochondrial Ca2+ uptake up to 4 hours, but after this period it returns to the levels measured in normal feeding conditions. I also investigated the possible involvement of a newly identified regulator of mitochondria Ca2+ uptake, MICU1, and we found that after 2 hours of glucose deprivation this regulator is quickly degraded. Based on its short half-life, we wondered whether during glucose deprivation MICU1 could be ubiquitylated and rapidly degraded. I also found that the proteasome inhibitor MG132 inhibits MICU1 degradation during glucose deprivation and it also increases MICU1 half-life. High-resolution mass spectrometry data reveal five lysines in MICU1 protein sequence that are reported to be ubiquitylated. Thus, I decided to substitute each one of these lysines with one arginine (K>R) in order to generate a MICU1 ubiquitylation incompetent mutant (MICU1K102R, K103R, K104R, K296R, K359R). Importantly, I found that the overexpression of MICU1K102R, K103R, K104R, K296R, K359R partially abolishes the effect of glucose deprivation on mitochondrial Ca2+ uptake. Further experiments will allow us to understand how MICU1 influences the modulation of the activity of mitochondrial Ca2+ transport system. The analysis of this mechanism will allow us to understand if mitochondria can be the link that directly connects glucose availability with the modulation of physio-pathological processes such as autophagy and apoptosis.

Le cellule eucariotiche hanno la necessità di adattarsi a cambiamenti nella disponibilità di metaboliti. Quando i livelli di nutrienti cambiano, il metabolismo cellulare si adatta rapidamente per proteggere la cellula stessa da eventuali danni. Questi rapidi cambiamenti sono regolati attraverso proteine che sono sensibili alla disponibilità di metaboliti. Le più importanti proteine coinvolte in questa risposta sono AMPK e le sirtuine (Dilova et al. 2007). Il Ca2+ è un secondo messaggero fondamentale che controlla numerose funzioni cellulari e il mitocondrio è uno degli organelli più importanti nel mantenimento dell’omeostasi del Ca2+ intracellulare (Rizzuto and Pozzan 2006). Recentemente, il gruppo di ricerca di Foskett ha identificato un nuovo ruolo per il trasferimento di Ca2+ che normalmente avviene dal reticolo endoplasmatico/sarcoplasmatico (ER/SR) ai mitocondri. Hanno quindi dimostrato che il Ca2+ trasferito è un segnale fondamentale per l'attivazione intracellulare di AMPK e per l’induzione di una risposta adattativa alla mancanza di nutrimenti qual è l’autofagia. Rimane ancora sconosciuto il segnale fisiologico all'interno della cellula che converte cambiamenti nella disponibilità di nutrimenti con variazioni nell’ampiezza dei transienti Ca2+ mitocondriali. Durante il mio dottorato di ricerca ho utilizzato l’equorina come sonda per misurare il Ca2+ all’interno dei vari comparti intracellulari (Pinton et al. 2007). Le nostre ricerche hanno dimostrato che cellule HeLa, private per due ore di un metabolita fondamentale qual è il glucosio, presentano transienti Ca2+ mitocondriali drasticamente ridotti. Misurare anche altri parametri mitocondriali ci ha fatto capire che questa risposta è fisiologica e reversibile e che avviene in molti tipi cellulari diversi. Inoltre ho indagato il ruolo di MICU1, un regolatore dei livelli di Ca2+ mitocondriale recentemente identificato, quale modulatore dei transienti Ca2+ mitocondriali durante l’assenza di glucosio. I nostri esperimenti dimostrano chiaramente come, dopo 2 ore di deprivazione del glucosio dal mezzo di coltura, questo fondamentale regolatore risulta essere rapidamente degradato. Mi sono quindi chiesta, vista la sorprendentemente breve semi-vita di MICU1, se durante la deprivazione di glucosio MICU1 potesse essere ubiquitinato e rapidamente degradato. A supporto di questa ipotesi, ho dimostrato che il trattamento delle cellule con l’inibitore del proteasoma MG132 inibisce la degradazione di MICU1 e ne aumenta la semi-vita. Inoltre, dati pubblicati di spettrometria di massa hanno rivelato cinque lisine nella sequenza proteica di MICU1 che sono predette essere ubiquitinate. Abbiamo quindi deciso di sostituire ognuna di queste lisine con arginine (K>R) in modo da generare un mutante incompetente per l’ubiquitinizzazione (MICU1K102R, K103R, K104R, K296R, K359R). La sovraespressione di questo mutante in cellule HeLa abolisce parzialmente l’effetto della deprivazione del glucosio sull’entrata di Ca2+ mitocondriale. Esperimenti futuri ci permetteranno di capire come MICU1 influenzi la modulazione dell’attività del trasporto di Ca2+ a livello mitocondriale. L’analisi di questo meccanismo ci permetterà di comprendere se il mitocondrio rappresenti un anello di congiunzione tra la disponibilità di glucosio e la modulazione di processi fisiopatologici quali l’autofagia e l’apoptosi.