Caratterizzazione di nuovi composti antivirali contro il citomegalovirus umano e studio del meccanismo di neuropatogenocità nel herpesvirus equino di tipo 1

Several members of the Herpesviride family are pathogens for both humans and animals. Both the human cytomegalovirus (HCMV) and the equine herpesvirus-1 (EHV-1) belong to this family and are subject of this study. HCMV is a pathogen of major importance, since it infects the major part of the human population all over the world. Although it causes infections that are asymptomatic or benign in the immunocompetent subjects, HCMV infection causes serious diseases (such as gastroenteritis, pulmonitis, retinitis) that can result even fatal in immuncompromised individuals, such as transplant recipients, AIDS patients, and immunodepressed. Indeed, HCMV is also a major cause of congenital defects in the newborn children. To date, there are a few drugs licenced for the treatment of HCMV infections, which are ganciclovir (GCV), cidofovir (CDV), and foscarnet (FOS), but none of them has been approved for the treatment of congenital infections. All these drugs are targeted at the viral DNA polymerase and they suffer from many drawbacks, such as poor bioavailability, long-term toxicity, and low effectiveness. Furthermore, the outcome of HCMV strains resistant to these drugs has become a serious problem in the management of transplant recipients, which become even worse because often the strains resistant to one drug often are cross-resistant to the others. For these reasons many efforts have been recently directed to the identification of new, less toxic, more effective anti-HCMV compounds with a mechanism of action different from that of the currently available drugs. One of the aims of this study was to identify new molecules with antiviral activity, directed in particular against HCMV, with a novel mechanism of action. Therefore, three different classes of molecules have been under investigation: some 6-aminoquinolone (6-AQ) derivatives, a compound (AL18), belonging to the AL compounds class (a series of molecule of different nature identified by HTS as inhibitors of the interaction between the two subunits of the HCMV-encoded DNA polymerase), and some sulfated derivatives of the K5 polysaccharide from E. coli. The 6-AQs and the K5 derivatives were assayed for the anti-HCMV activity. Then the most promising molecules selected for further characterisation of their antiviral properties were assayed: for the activity against other herpesviruses, to identify the step in the replication cycle that was affected, and finally to elucidate their mechanism of action. AL18 was assayed for its activty against herpesviruses other than HCMV and for its specificity. These studies led to the identification of a 6-AQ, WC5, with specific anti-HCMV activity and of two sulfated derivatives of K5 polysaccharide from E. coli, K5-N,OS (H) and (L), that act by blocking HCMV infectivity. Furthermore, we demonstrated that AL18 is a specific anti-HCMV agent that represents the ideal candidate for the development of new drugs targeted at the viral DNA polymerase, but with a mechanism of action that differs from that of the currently available anti-HCMV drugs. The second part of this study regards EHV-1, which is a major pathogen for horses, causing diseases ranging from respiratory infections to induction of abortion, up to neuropathologies that can result in paralysis or be fatal for the animal. Recently, we characterised the DNA polymerase complex of EHV-1 and analysed the effects of some polymorfisms identified in field isolates on its enzymatic activity. Infact, since the range of EHV-1-induced pathologies is so broad, it has been hypothesised that different strains may exist with different neuropathogenic potential. To test this hypothesis, the genomic sequences of several EHV-1 strains have been compared in order to identify genetic markers associated with the neuropathogenic potential. It has been demonstrated that only a single aminoacid variation (D/N752) in the catalytic subunit of the viral DNA polymerase is associated with the neuropathogenic potential and that this change is able to reduce the virulence of the respective virus strain and to increase the sensitivity to a polymerase inhibitor, aphidicolin (AFC), that acts by competing with dNTPs substrates. Therefore, we performed some biochemical assays with the D/N752 polymerase variants to determine the affinity costants (KM) for dNTPs and the inhibition costants (KI) for AFC, to highlight biochemical differences that could explain the differences in the neuropathogenic potential showed in vivo by the two viruses. From these studies we observed that the non-neuropathogenic N752 variant has lower affinity for two of the dNTPs substrates than the neuropathogenic D752 variant does. Furthermore, the N752 variant is more sensitive to AFC than the D752 variant. These biochemical observations support the hypothesis that the two polymerase variants have a different biochemical "behaviour" with respect of the dNTPs substrates and contribute to the formulation of a model that may eplain the differences in the neuropathogenic potential showed by the different viral strains.

La famiglia Herpesviridae comprende molti virus, patogeni sia per l'uomo che per gli animali. A questa famiglia appartengono anche il citomegalovirus umano (HCMV) e l'herpesvirus equino di tipo 1 (EHV-1), che sono oggetto di questo studio. HCMV è un patogeno di enorme importanza, dal momento che esso infetta la maggior parte della popolazione mondiale. Sebbene esso causi patologie asintomatiche o benigne nei soggetti immunocompetenti, l'infezione da HCMV è causa di patologie molto gravi (come gastroenteriti, polmoniti, retiniti, ecc.) che possono risultare anche fatali nei pazienti immunocompromessi, come trapiantati, affetti da AIDS e immunodepressi. Inoltre, HCMV è anche la prima causa di malformazioni e difetti congeniti nei neonati. Attualmente esistono alcuni farmaci approvati per il trattamento delle infezioni da HCMV, tra cui ganciclovir (GCV), cidofovir (CDV) e foscarnet (FOS), anche se nessuno di questi è stato approvato per il trattamento dell'infezione congenita. Tali farmaci hanno tutti come bersaglio comune la DNA polimerasi virale e hanno svantaggi non trascurabili, come la scarsa biodisponibilità, la tossicità elevata a lungo termine e la bassa efficacia. Inoltre, la comparsa di ceppi di HCMV resistenti a questi farmaci sta diventando un gravissimo problema nel management dei pazienti trapiantati, aggravato dal fatto che spesso i ceppi resistenti a un farmaco sono cross-resistenti anche agli altri. Per questi motivi, negli ultimi anni sono stati fatti grandi sforzi nella ricerca di nuovi composti anti-HCMV, meno tossici, più efficaci e soprattutto con un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci di cui si dispone attualmente. Uno degli obbiettivi di questo studio è stato quello di identificare e caratterizzare nuove molecole con attività antivirale, in particolare dirette contro HCMV e dotate di un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci commercializzati. Per questo scopo sono stati presi in considerazione tre tipi diversi di molecole: alcuni derivati 6-amminochinolonici (6-AQ), alcuni derivati solfatati del polisaccaride K5 di E. coli e un composto (AL18) della serie AL (insieme di molecole di diversa natura chimica identificate mediante HTS come inibitori dell'nterazione tra le subunità  della DNA polimerasi di HCMV). Per i 6-AQ e i derivati di K5 è stata saggiata l'attività contro HCMV e, una volta identificate le molecole più promettenti per le loro proprietà antivirali, sono stati effettuati diversi studi per caratterizzare ulteriormente la loro attività contro HCMV e altri herpesvirus, per definire lo stadio del ciclo replicativo virale in cui essi agiscono e per chiarire a livello molecolare il loro meccanismo d'azione. Invece, per quanto riguarda AL18, sono stati effettuati studi riguardanti la specificità contro HCMV rispetto ad altri herpesvirus. Questi studi hanno portato all'identificazione di un 6-AQ, WC5, con potente attività antivirale specifica per HCMV e di due derivati solfatati del polisaccaride K5 di E. coli, K5-N,OS (H) e (L), che agiscono bloccando l'nfettività di HCMV. Inoltre si è potuto dimostrare che il composto AL18 è specifico per HCMV e che rappresenta quindi un candidato ideale per lo sviluppo di nuovi farmaci sempre diretti contro la DNA polimerasi di HCMV, ma dotati di un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci attualmente utilizzati in terapia. La seconda parte del progetto riguarda EHV-1, che è un patogeno molto importante per i cavalli, essendo in grado di causare patologie che vanno dalle infezioni respiratorie, all'induzione di aborto e fino a neuropatologie che possono portare anche alla paralisi e alla morte dell'animale. Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha caratterizzato il complesso della DNA polimerasi di EHV-1 e l'effetto che alcuni polimorfismi riscontrati in isolati virali hanno sulla sua attività enzimatica. Infatti, data la varietà di patologie indotte da EHV-1, è stato ipotizzato che esistessero diversi ceppi con un diverso potenziale neuropatogenico a causa di un diverso corredo genetico e per questo sono state comparate le sequenze genomiche di numerosi ceppi di EHV-1, con lo scopo di identificare potenziali marcatori genetici associabili al potenziale neuropatogenico. E' stato dimostrato che l'unica variazione amminoacidica (D/N752) associata al potenziale neuropatogenico si trova nella subunità  catalitica della DNA polimerasi virale ed è in grado di provocare una attenuazione generale nella virulenza del ceppo da cui viene espressa e una maggiore sensibilità della polimerasi virale a un inibitore che agisce per competizione con i substrati nucleotidici, l'afidicolina (AFC). Per questo motivo sono stati effettuati dei saggi biochimici con le due varianti polimerasiche D/N752 per determinare le costanti di affinità (KM) per i substrati nucleotidici e di inibizione (KI) per AFC, con lo scopo di evidenziare delle eventuali differenze dal punto di vista biochimico in grado di contribuire alla delucidazione del meccanismo responsabile del diverso grado di neuropatogenicità  dimostrato in vivo dai rispettivi virus. Da questi studi è emerso che la variante N752 non-neuropatogenica ha un'affinità minore per due dei substrati nucleotidici rispetto alla variante D752 neuropatogenica. Inoltre, la variante N752 ha maggiore affinità per l'inibitore AFC rispetto alla variante D752. Questi dati biochimici supportano l'ipotesi di un diverso "comportamento" biochimico delle due varianti proteiche della DNA polimerasi virale nei confronti dei loro substrati dNTPs e contribuiscono alla formulazione di un modello per spiegare le differenze nel potenziale neuropatogenico dei diversi ceppi virali.