Selezione e caratterizzazione di microrganismi destinati alla produzione di distillati

Grappa is an alcoholic beverage obtained from the distillation of grape pomace derived from grapes produced exclusively in Italy. The process of production of Grappa starts in the winery where winemaking takes place: after harvesting and grape crushing, the must is separated from grape marcs mainly composed by grape skins and seeds, with or without rasp. In the case of red winemaking, separation of marcs takes place after maceration when fermentation has already started, so that they contain alcohol and a low quantity of sugar. On the contrary, marcs obtained from white winemaking contain sugars not yet fermented. For this reason in this second case the raw vegetable material conferred to the distillery is stored for a variable period to allow alcohol production to occur. Marcs can be conserved in different manners, using silos or smaller containers such as plastic tunnels, for period lasting from few days to several weeks. During this period, the main chemical process is sugar degradation and alcohol production, carried out by yeasts, although a large number of other molecules with positive (aromatic substances) or negative (off-flavours and toxic compounds) effect can rise from the activity of the indigenous microflora. Among the technological supports (pH improvement, temperature control, anaerobic environment) developed by modern distilleries to avoid spoiling of the raw material due to unsuitable storing conditions the management of microbial populations by means of selected yeast introduction is pursued. Concerning the case of grappa, international studies are almost absent, as its production is limited by the legislation to our national territory. This study is part of a wider project, supported by Regione Veneto, concerning the selection of an yeast to be inoculated in grape marcs destined to the production of grappa. The first objective to be achieved was about the study of the composition and population dynamics of the yeast microflora of grape marcs using conventional and molecular methods present in literature or studied by the Microbiology Unit working at the Department of Agricultural Biotechnology. Two white grape varieties, namely Moscato and Prosecco, from two distinct areas of the Veneto Region, were used. Yeast counts were made at the beginning, after 4 and after 15 days of marc storage under anaerobic conditions. Seventy isolates from each sampling time were identified to species by RAPD-PCR analysis and subsequent ITS region sequencing. A good biodiversity of yeasts occurred in both marcs at the beginning of fermentation, with high presence of Hanseniaspora opuntiae, but without detectable presence of Saccharomyces strains, which instead became the dominant yeast after just 4 days of fermentation, remaining at that level until the end of fermentation. Colonization of Moscato marc by S. cerevisiae resulted better, in relation to its higher sugar content. Characterization of S. cerevisiae isolates by mitochondrial DNA restriction analysis revealed the presence of 66 different strains in the marc from the Moscato grapes, without the occurrence of a clearly dominant strain, while in the marc from the Prosecco grapes only 23 different profiles were scored, with a dominant strain that accounted for 62.7% of the Saccharomyces population after 4 days of fermentation. Subsequentely, the effects of refrigeration and acidification treatments of grape pomace on dynamics of yeast populations during the storage period have been studied. A total of 200 isolates were collected from Prosecco grape marcs acidified and non acidified, after 4 and 15 days from the beginning of storage. Identification of enological yeasts belonging to Saccharomyces sensu stricto group was performed by means of a multiplex PCR, and their characterization at strain level was achieved by mitochondrial DNA restriction analysis. Genetic analyses evidenced the development of different microbial strains in the acidified environment and in the non-acidified control. Acidification treatment, applied to inhibit bacterial microflora, disclosed to be able to influence yeast population from a qualitative rather than quantitative point of view. pH decreasing caused a great effect of selection, indeed only 18 out of 121 identified strains were found in both conditions. A total of 104 isolates identified as belonging to Saccharomyces cerevisiae group were chosen from a pool of about 1000 yeasts collected in various experimentations, from marcs of different origin or submitted to technological treatments during the ensilage period. Such isolates were grown in a synthetic must formulation in order to investigate their fermentation performances. Yeast strains isolated from Moscato grape marcs showed the best features in terms of vigour, expressed as sugar consumption after 2 and 7 days of fermentation. The level of foam production was also investigated and a sensory evaluation was conducted at the end of fermentation, mainly to evaluate possible off-flavour production. Other technological traits such as the level of resistance to the antioxidant sulphur dioxide and the hydrogen sulphide production were tested. Considering SO2 resistance all isolates are able to tolerate the concentration of 50 mg/l, commonly used in the winery. At the intermediate dose of 100 mg/l the most resistant strains come from non acidified Prosecco marc. Moreover, it is stated that microbial glycosidase activity contributes to wines and distillates aroma through the hydrolysis of non-volatile flavourless glycoconjugate precursors, which releases free terpenols and other aromatic compounds. Glycosides, composed of a terpenic hydrocarbon (aglycon) and a carbohydrate moiety, are concentrated in grape berries hence contribution of glycosidase activity is determinant for the expression of Grappa aroma. So, from all these isolates ?-glucosidase activity was rapidly screened both by using a newly developed fluorimetric method and by growing the cells in a minimal medium containing the disaccharide cellobiose as the only carbon source. Both the technological and quality traits found for all the isolates were submitted to a statistical analysis in order to detect yeast strains with the best overall characteristics, to be used as starter for distillate production. Recently the ?-glucosidase activity was suggested to be related to the major exo- ?-1,3-glucanase EXG1 of Saccharomyces cerevisiae, which is involved in processes like growth, budding and mating. For this reasons the molecular approach based on construction of mutant strains in exoglucanases genes was recently considered. In particular two deletion mutant for EXG1 and EXG2 genes respectively has been constructed, following a protocol essentially based on homology recombination. The effect of gene knock-out on ?-glucosidase activity was ascertained through fluorimetric assays, showing a little reduction in exg1 null mutant. Growth in Prosecco must was also performed, in 1L bioreactors, but fermentation curves did not reveal significative differences among strains, showing that probably deletion of exoglucanase genes do not influence yeast growth. All the showed results indicate that grape marcs of different origins or submitted tocdifferent technological treatments are a variable source of yeasts that can be selected to be inoculated as starter for grappa production.

La grappa è una bevanda alcolica ottenuta dalla distillazione di vinacce derivate da uve prodotte esclusivamente in Italia. Il processo produttivo comincia in cantina dove ha luogo la vinificazione: dopo la raccolta e la pigiatura dell’uva, il mosto è separato dalle vinacce, costituite principalmente dalle bucce e dai vinaccioli, con o senza raspi. Le vinacce ottenute dalla vinificazione in bianco contengono zuccheri non ancora fermentati. Per questo motivo il materiale vegetale conferito alla distilleria è conservato per un periodo variabile per consentire lo svolgimento della fermentazione alcolica. Le vinacce possono essere conservate da pochi giorni ad alcune settimane in diversi modi, in silos o in tunnel di plastica. Durante questo periodo, il principale processo chimico che avviene ad opera dei lieviti è la degradazione degli zuccheri con produzione di alcol, anche se un numero elevato di altre molecole con effetti positivi (sostanze aromatiche) e negativi (composti tossici), può originare dalla microflora indigena. Con lo scopo di evitare il deterioramento del materiale vegetale dovuto a inopportune condizioni di stoccaggio, le moderne distillerie hanno introdotto l’uso di alcuni trattamenti tecnologici (miglioramento del pH, controllo della temperatura, assenza di ossigeno), e recentemente ha trovato interesse anche l’impiego di lieviti selezionati per il controllo della popolazione microbica. A questo proposito, studi internazionali nel campo della grappa sono pressocchè assenti, essendo la sua produzione limitata per legge al nostro territorio nazionale. Questo studio si inserisce nell’ambito di un più ampio progetto, finanziato dalla Regione Veneto, di selezione di lieviti da usare come starter da inoculare nella vinaccia destinata alla produzione di grappa. Il primo obiettivo da perseguire era lo studio della composizione e delle dinamiche di popolazione della microflora di lieviti, mediante metodi convenzionali e molecolari presenti in letteratura o studiati dal gruppo di Microbiologia del Dipartimento di Biotecnologie Agrarie. Sono state scelte due varietà di grappa, Moscato e Prosecco, provenienti da due distinte aree della Regione Veneto. Le conte della popolazione di lieviti sono state effettuate all’inizio, dopo 4 e 15 giorni di stoccaggio in condizioni di anaerobiosi. Una settantina di isolati per ogni campionamento sono stati identificati a livello di specie mediante analisi RAPD-PCR e successivo sequenziamento della regione ITS. All’inizio dello stoccaggio si è osservata una buona biodiversità in entrambe le vinacce, con un’alta percentuale di Hanseniaspora opuntiae, ma assenza di ceppi di Saccharomyces, che invece diventano dominanti dopo soli 4 giorni di fermentazione, attestandosi allo stesso livello fino alla fine della fermentazione. Successivamente sono stati studiati gli effetti dei trattamenti di refrigerazione e acidificazione sulle dinamiche delle popolazioni di lieviti durante lo stoccaggio. Sono stati collezionati un totale di 200 isolati da vinacce di Prosecco acidificate e non acidificate, dopo 4 e 15 giorni di stoccaggio. L’identificazione di ceppi enologici appartenenti al gruppo Saccharomyces sensu stricto è stata effettuata mediante multiplex PCR, e la loro caratterizzazione a livello di ceppo è stata ottenuta con l’analisi del DNA mitocondriale. Le analisi genetiche hanno evidenziato lo sviluppo di ceppi diversi nell’ambiente acidificato e nel controllo non acidificato. Il trattamento di acidificazione, applicato per inibire la microflora batterica, si è rivelato in grado di influenzare la popolazione di lieviti dal punto di vista qualitativo piuttosto che quantitativo. La diminuzione del pH ha provocato un grosso effetto di selezione, infatti solo 18 dei 121 ceppi identificati sono stati trovati in entrambe le condizioni. Un totale di 104 isolati identificati come appartenenti al gruppo Saccharomyces cerevisiae sono stati scelti da un pool di circa 1000 lieviti, collezionati nel corso delle diverse sperimentazioni, da vinacce di diversa origine o sottoposta a trattamenti tecnologici durante il periodo di insilamento. Gli isolati sono stati cresciuti in mosto sintetico per verificare le loro performance di fermentazione. I lieviti isolati da vinacce di Moscato mostrano le caratteristiche migliori in termini di vigore fermentativo, espresso come consumo di zucchero dopo 2 e 7 giorni di fermentazione. E’ stato indagato anche il livello della produzione di schiuma, e alla fine della fermentazione è stata condotta una valutazione sensoriale per individuare i possibili odori sgradevoli. Sono stati esaminati anche altre caratteristiche tecnologiche, quali la resistenza all’antiossidante e antisettico anidride solforosa e la produzione di idrogeno solforato. Considerando la resistenza alla SO2 tutti gli isolati sono in grado di tollerare una concentrazione di 50 mg/l, comunemente usata in cantina. Alla dose intermedia di 100 mg/l i ceppi più resistenti provengono da vinacce di Prosecco non acidificate. Inoltre, è noto che l’attività glicosidasica microbica contribuisce all’aroma di vini e distillati attraverso l’idrolisi di precursori glicoconiugati non volatili e inodori, che rilasciano terpenoli e altri composti aromatici. I glicosidi, composti di un’idrocarburo terpenico (aglicone) e di un carboidrato, sono concentrati nella buccia, perciò il contributo dell’attività glicosidasica è determinante per l’espressione dell’aroma della grappa. L’attività ?-glucosidasica pertanto, è stata rapida mente testata in tutti gli isolati sia utilizzando un metodo fluorimetrico appositamente messo a punto, sia crescendo le cellule in un terreno minimo contenente il disaccaride cellobiosio come sola fonte di carbonio. I caratteri tecnologici e di qualità monitorati per tutti gli isolati sono stati sottoposti ad analisi statistica con lo scopo di individuare i lieviti con le caratteristiche complessive migliori per essere utilizzati come starter nella produzione di distillati. Recentemente è stato suggerito che l’attività ?-glucosidasica sia correlata alla maggiore eso- ?-1,3- glucanasi EXG1 di Saccharomyces cerevisiae, coinvolta in processi come crescita, gemmazione e mating. Per questi motivi è stato preso in considerazione un approccio basato sulla costruzione di mutanti per i geni codificanti per esoglucanasi. In particolare sono stati costruiti due mutanti di delezione per i geni EXG1 ed EXG2 rispettivamente, seguendo un protocollo basato essenzialmente sul principio della ricombinazione omologa. L’effetto della delezione sull’attività ?-glucosidasica è stato provato con il saggio fluorimetrico, evidenziando una lieve diminuzione nel mutante nullo exg1. Inoltre i ceppi mutati sono stati cresciuti in mosto naturale di Prosecco, in fermentatori da 1L, ma le curve di fermentazione non hanno rivelato differenze significative tra i ceppi. E’ possibile concludere perciò che probabilmente la delezione dei geni per le esoglucanasi non influenza la crescita dei lieviti. I risultati ottenuti complessivamente indicano che le vinacce di diversa origine o sottoposte a trattamenti tecnologici rappresentano una fonte ampia di lieviti che possono essere selezionati come starter nel campo della produzione della grappa.