Evaluation of the Non-Conventional Yeast Starmerella Bacillaris as Biocontrol Agent and Selected Starter for Alcoholic Beverages Production

Yeasts are the main protagonists of the alcoholic fermentation and strongly influence the final characteristics of wine and other alcoholic beverages. In winemaking, during spontaneous fermentation, this process is carried out by indigenous yeasts present on the grape berry and there is a progressive growth pattern of different yeast species, with the final stages invariably being dominated by the alcohol-tolerant strains of Saccharomyces cerevisiae. This species is universally known as the ‘wine yeast’ and is widely preferred for initiating wine fermentations. From a technological point of view spontaneous grape juice fermentations sometime become stuck or sluggish. This lack of reproducibility and predictability has favored, in the past, the use of yeast starters, generally composed of single strains of S. cerevisiae. Selected S. cerevisiae strains predominate during must fermentation, ensure rapid and reliable grape juice fermentation and, as consequence, consistent and predictable wine quality. However, there has been increasing recognition that wines made with Saccharomyces starter cultures are less complex, producing standardized wines. In fact, during spontaneous fermentation many other species (the so call non–Saccharomyces yeasts) are present in the grape must and traditionally they were considered deleterious as responsible for some wine off-flavors. Recently, the role of non-Saccharomyces species has been re-evaluated as some of them has been proposed as co-starter to simulate natural must fermentation and to confer greater complexity and specificity to the wine. In this context, the thesis project was developed in order to select new non-Saccharomyces yeast strains from fermenting musts of overripe grape berries. This stage of grape ripening is characterized to be more susceptible to infection of fungal pathogens such as Botrytis cinerea, whom yeasts present on the berry surface have to compete with. Thirty-six isolates were identified as Starmerella bacillaris isolated from destemmed dried grape of Raboso Piave variety, grown on Bagnoli DOC (Appellation of Origin) area (North-East of Italy). This species is recently proven to be of oenological interest mainly for its high glycerol production. Among them, 14 strains were phenotypically characterized and, for the first time, the antifungal activity of S. bacillaris species against B. cinerea and P. expansum were demonstrated. Moreover, fermentation performances of S. bacillaris strains were evaluated in synthetic, grape and apple musts (for the first time in cider production). When tested in sequential fermentations with S. cerevisiae this yeast improved the quality of wine and cider. The obtained results indicate that S. bacillaris can be proposed as biocontrol agent on grape in vineyard and during postharvest on stored apples and its presence on fruit surface positively influences the following juice fermentation. Therefore the released of this yeast in the vineyard can increase the sustainability of the production process and the final wine quality. The obtained results provide a solid basis for a new management of yeast used for winemaking and other alcoholic beverage production and open new prospects for a more integrated strategy to increase wine quality. Then, in this thesis, new S. bacillaris characteristics were evaluated in order to improve alcoholic beverages quality, such as mannoproteins and glutathione production. The quantification of these compounds was determined at the end of fermentation in synthetic must. S. bacillaris was proved to produce different mannoproteins with functional characteristics related to wine stability. Mannoproteins extracted from S. bacillaris cultures presented great potential in increasing the protein stabilization, while if they were produced during sequential fermentation with S. cerevisiae, enhanced the tartaric stabilization. Moreover, in this thesis, a very high glutathione content was demonstrated in S. bacillaris cells after fermentation. Therefore, yeast lees obtained from S. bacillaris fermentations can be proposed as as glutathione source. In the last part of this thesis the aim was to understand the genomic determinants of S. bacillaris technological traits described in the previous parts. Therefore. the whole-genome sequence of two relevant S. bacillaris strains was performed. By means of genome comparisons between the two S. bacillaris strains and between S. bacillaris, S. cerevisiae and other oenological yeasts, specific genes and metabolic pathways involved in technologically-relevant traits were identified and studied.

I lieviti sono i principali protagonisti della fermentazione alcolica e influenzano fortemente le caratteristiche finali del vino e di altre bevande alcoliche. Nella vinificazione, durante una fermentazione spontanea,questo processo viene effettuato da lieviti autoctoni presenti sulla bacca di uva. Alla fine della fermentazione la specie dominate tra i ceppi è Saccharomyces cerevisiae. Questa specie è universalmente conosciuta come il 'lievito di vino' ed è ampiamente preferita per iniziare fermentazioni del vino. Da un punto di vista tecnologico, le fermentazioni spontanee di succo d'uva si sono spesso bloccate. In passato, questa mancanza di riproducibilità e prevedibilità non era favorevole per una produzione di vino di qualità. L’uso di ceppo di lievito, generalmente composti da singoli ceppi come ad esempio S. cerevisiae aiuta a controllare questo problema. I ceppi selezionati di S. cerevisiae predominano durante la fermentazione del mosto, assicurando una rapida e affidabile fermentazione e, di conseguenza, una qualità del vino coerente e prevedibile. Tuttavia, si è accresciuto la convinzione che i vini ottenuti con culture di starter Saccharomyces siano meno complesse, producendo vini standardizzati. Infatti, durante la fermentazione spontanea, nel mosto d'uva sono presenti molte altre specie (i cosiddetti lieviti non Saccharomyces) e tradizionalmente sono stati considerati come responsabili di alcuni sapori no aggradevoli all’assaggio del vino. Recentemente, il ruolo delle specie non Saccharomyces è stato rivalutato poiché alcune di esse sono state proposte come co-avviatore per simulare la fermentazione dei mosti naturali e per conferire maggiore complessità e specificità al vino. In questo contesto, il progetto di tesi è stato sviluppato per selezionare nuovi ceppi di lievito non Saccharomyces da mosti fermentativi di uva passito. Questa fase di maturazione dell'uva è caratterizzata per essere più suscettibile all'infezione di patogeni fungini come Botrytis cinerea. I trentasei isolati sono stati identificati come Starmerella bacillaris , isolati da uve secche della varietà Raboso Piave, coltivate in zona Bagnoli DOC (denominazione d'origine) (nord-est dell'Italia). Questa specie è recentemente dimostrata di interesse enologico soprattutto per la sua elevata produzione di glicerolo. Tra questi, 14 ceppi sono stati caratterizzati fenotipicamente e, per la prima volta, sono stati dimostrati l'attività antifungina delle specie S. bacillaris contro B. cinerea e P. expansum. Inoltre, le prestazioni di fermentazione dei ceppi di S. bacillaris sono state valutate nei mosti sintetici, uve e mele (per la prima volta nella produzione di sidro). Durante la sperimentazione, questo lievito ha migliorato la qualità del vino e del sidro in fermentazioni sequenziali con S. cerevisiae. I risultati ottenuti indicano che S. bacillaris può essere proposto come agente biocontrollo sull'uva nel vigneto e durante la post-raccolta sulle mele conservate: la sua presenza sulla superficie di frutta influenza positivamente la seguente fermentazione dei succhi. Pertanto, il rilascio di questo lievito nel vigneto può aumentare la sostenibilità del processo produttivo e la qualità finale del vino. I risultati ottenuti forniscono una solida base per una nuova gestione del lievito utilizzato per la produzione di vino e altre bevande alcoliche e aprire nuove prospettive per una strategia più integrata per aumentare la qualità del vino. Sono state valutate le nuove caratteristiche di S. bacillaris al fine di migliorare la qualità delle bevande alcoliche, come le manoproteine e la produzione di glutatione. La quantificazione di questi composti è stata determinata alla fine della fermentazione in mosto sintetico. S. bacillaris ha dimostrato di poter produrre mannoproteine diverse, con caratteristiche funzionali legate alla stabilità del vino. Le manoproteine estratte dalle colture di S. bacillaris presentavano un grande potenziale per aumentare la stabilizzazione delle proteine, mentre se venivano prodotte durante la fermentazione sequenziale con S. cerevisiae, aumentavano la stabilizzazione tartarica. Inoltre, in questa tesi, è stato rilevato un contenuto di glutatione molto elevato in cellule S. bacillaris dopo la fermentazione. Pertanto, le fecce ottenute dalle fermentazioni di S. bacillaris possono essere proposte come fonte di glutatione. Nell'ultima parte di questa tesi si intendeva comprendere le determinanti genomiche delle caratteristiche tecnologiche di S. bacillaris descritte nelle precedenti parti. Per questo è stata eseguita la sequenza intero-genoma di due importanti ceppi S. bacillaris. Con i confronti genomici tra i due ceppi di S. bacillaris e tra S. bacillaris, S. cerevisiae e altri lieviti enologici, sono stati identificati e studiati geni specifici e i percorsi metabolici coinvolti in tratti tecnologicamente rilevanti.