An integrated proteomic and genomic approach to study FAP patients without APC and MutHY mutations

Familial Adenomatous Polyposis (FAP) is one of the most important clinical forms of inherited susceptibility to colorectal cancer, that is characterized by the development of hundreds to thousands of adenomas in the colon and rectum during the second decade of life. FAP is due to a germline mutation in the APC gene or to biallelic variations of MutYH gene. Almost all patients will develop cancer if the disease is not identified and surgically treated at an early stage. The aim of this study was to characterize, by peptidomic and genetic approaches, 4 pa-tients that, although at the colonoscopy showed many polyps, they did not present any mutations of APC and MutYH genes (defined here unresolved FAP). Regarding the peptidomic study, MALDI-TOF analysis was performed on mutated and unresolved FAP patients. These data were compared with the one from adenoma patients, CRC patients and healthy control subjects. The peptide fingerprint of mutated FAP patients was obtained after performing statistical analysis. A subset of 45 ionic species was found differently expressed in the four groups considered, 12 of them peculiar of FAP patients. Four ionic species were found significantly different in the switch between adenoma and malignant carcinoma. In this study, the potentially prognostic peptides identified derive mainly from circulating proteins and some of them are involved in the inflammatory response. In particular, proteins such as Complement C3 and C4 are known to be cleaved by exoproteases that seem pathology-related. In the case of unresolved FAP patients, in order to better define a specific pattern, the data from MALDI-TOF were combined with whole exome sequencing. The peptidomics data clearly mark a substantial difference between mutated and unresolved FAP patients. Indeed, unresolved FAP patients have characteristics similar to the control subjects, adenoma patients, CRC patients but not to mutated FAP patients. To understand the possible molecular pathway involved in the unresolved FAP cases, the whole exome sequencing (WES) was performed. From WES data analysis, 285 genes present in all the four unresolved FAP patients were filtered and selected. Among them, the O-linked glycans pathway of the mucins was the most represented. In conclusion, in this study it was defined for the first time a specific panel of peptides for mutated FAP patients, that could be useful to monitor and predict the pathological evolution of adenocarcinoma malignancy. Furthermore, it was possible to characterize a preliminary genetic variations pattern for unresolved FAP patients, in which mucin genes might represent the key of the molecular pathway involved. However, further study are necessary to relate the identified mucin gene variations to their possible causative role in the polyposis. Future analysis of this pattern will be helpful, indeed, to better understand the interatome (the biological network that in-cludes the whole set of direct and indirect molecular interactions in a cell) of these un-resolved FAP patients.

La poliposi adenomatosa familiare (FAP) è una delle più importanti forme cliniche di cancro colo-rettale ereditario ed è caratterizzata dallo sviluppo di centinaia/migliaia di polipi adenomatosi nel colon e nel retto durante la seconda decade di vita. La FAP è causata da una mutazione germinale del gene APC o da varianti bialleliche del gene MutYH. Quasi tutti i pazienti FAP sviluppano il cancro se la patologia non viene precocemente identificata e trattata chirurgicamente. Lo scopo di questo lavoro è stato caratterizzare 4 pazienti in cui, nonostante l’esame colonscopico presentasse una poliposi conclamata, non risultavano mutazioni nei gene APC e MutYH (in questa tesi definiti pazienti FAP irrisolti) utilizzando un approccio integrato di peptidomica e genomica. Riguardo la peptidomica, il MALDI-TOF è stato utilizzato per studiare il profilo peptidico plasmatico di pazienti FAP mutati ed irrisolti comparando i dati ottenuti con quelli derivanti dallo studio di pazienti con adenoma, cancro colo-rettale e soggetti sani di controllo. Dopo analisi statistica è stato ottenuto il fingerprint peptidico dei pazienti FAP mutati. Sono state ottenute 45 specie ioniche differentemente espresse nei quattro gruppi considerati, 12 delle quali peculiari per i pazienti FAP. L’intensità di segnale di quattro di queste specie ioniche è stata trovata statisticamente alterata nello switch tra adenoma e carcinoma maligno. I peptidi potenzialmente prognostici identificati in questo studio derivano principalmente da proteine circolanti, alcune delle quali implicate nella risposta infiammatoria. In particolare è noto dalla letteratura che proteine del sistema del complemento come C3 e C4 vengono tagliate da esoproteasi che sembrano essere patologia correlate. Riguardo ai pazienti FAP irrisolti, per definirne un pattern specifico, i dati derivanti dall’analisi con il MALDI-TOF sono stati combinati con quelli ottenuti dal sequenzia-mento dell’esoma. I dati di peptidomica hanno chiaramente evidenziato le differenze tra pazienti FAP mutati e FAP irrisolti. Infatti i pazienti FAP irrisolti presentano caratteristiche simili a quelle dei soggetti di controllo, dei pazienti con adenoma e cancro colo rettale ma non a quelle dei pazienti FAP mutati. Allo scopo di capire la via di trasduzione del segnale implicata, è stato quindi eseguito il sequenziamento dell'esoma dei pazienti FAP irrisolti. Da questa analisi sono stati selezionati 285 geni variati in tutti i pazienti e tra questi la via di trasduzione del segnale della O-glicosilazione delle mucine è risultata la più rappresentata. In conclusione, in questo studio è stato definito per la prima volta un set peptidico specifico per i pazienti FAP mutati che potrebbe essere utilizzato per monitorare e predire l’evoluzione patologica della malattia. Inoltre è stato possibile caratterizzare un pattern preliminare per i pazienti FAP irrisolti in cui i geni delle mucine potrebbero rappresentare la chiave della via di trasduzione del segnale implicata. Ulteriori studi saranno necessari per correlare i geni delle mucine con la poliposi e costruire l'interatoma (network biologico definito come l’insieme di tutte le interazioni molecolari dirette e indirette che ci sono all'interno di una cellula e di un organismo) di questi pazienti FAP irrisolti.