A systems biology approach to shed light on apple fruit development

The research carried out and discussed in the present dissertation is positioned within the “TranscrApple” project (www.transcrapple.com), funded by the Provincia Autonoma di Trento (PAT) within the call “Grandi Progetti 2012”. The general objectives of this project, a significant part of which overlap with the present thesis, deal with the characterization, as wide as possible with the currently available technologies, of the transcriptional events, including those related to small RNAs (not discussed in the present dissertation), the metabolic changes, on a subset of primary and secondary metabolites, and hormones’ cross-talk, through a hormone profiling approach, occurring during apple fruit development. The present thesis is organized in different chapters, mirroring the experimental and temporal rationale effectively pursued to develop the research herein described. The main objective of the present work deals not only with providing an overview of transcripts, metabolites and hormones and their variations during fruit development, but also with the setting up of technical and experimental solutions aimed at using the achieved information within an integrative platform, according to a “systems biology view”. In model species, all this kind of studies are extremely easier, thanks to the availability of ready-to-use bioinformatics tools that are not flexible enough to be used in other species. However, especially in tree crops, this approach is still far from being defined and standardized. Chapter 1 introduces the theme “apple fruit development”, discussing the adoption of apple as a model system that, in the last decade, acquired great importance in terms of research among the fruit species thanks to the availability of its sequenced genome. After a brief introduction on the fundamental information available about the apple fruit growth, taking into account the technological and scientific points of view, few difficulties and gaps that hamper the achievement of a complete overview of the regulatory events coordinating the development and growth of the apple, are discussed in relation to the main quantitative and qualitative parameters characterizing the apple fruit production. Chapter 2 enters into the apple fruit research area; the preliminary phase and the multiple validations (concerning different cultivars and seasons) of transcriptional markers during the main apple developmental stages were shown to be fundamental for choosing, on the base of the expression profiles of these genes, the most representative samples, among those collected also in different seasons. Several markers have been identified, validated and employed, among those available from literature, allowing the selection of samples of cv Golden Delicious (herein considered as model) to be used for the subsequent transcriptional and metabolomic characterization carried out in the present research. Chapter 3 deals with the hormonal profiling survey carried out along the apple fruit development for the first time in this species. The results have allowed not only the achievement of brand new data related to the major hormonal classes, to be employed for further researches, but also the clarification and/or confirmation of new hormonal interactions connected to the fruit development stage or the transition between stages. Moreover, the relevance of this study consists in having achieved, for the first time in apple, quantitative data of an important set of hormones concurrently on the same samples. Chapter 4 concerns the survey on the metabolites and their variations during the apple fruit development. A complete overview of the changes of the different classes of metabolites (mainly sugars, organic acids, aminoacids and polyphenols) is given during the apple developmental cycle. The acquired data have been derived from the same samples already analyzed in the previous chapters, and will be integrated with data of diverse nature, such as the RNAseq. Chapter 5 of the present thesis comes into the “system biology” area, initially among several technical difficulties, then partially solved, and gives an example of an alternative interpretation of the hormonal data put within a correlative network along with the RNAseq results achieved on the same samples.

Le ricerche illustrate nella presente tesi di dottorato si collocano nell’ambito del progetto “TranscrApple” (www.transcrapple.com), finanziato dalla Provincia Autonoma di Trento (PAT) nell’ambito del bando Grandi Progetti 2012. Gli obiettivi generali del progetto, che in larga parte si accomunano a quelli della presente tesi, prevedono di caratterizzare, nella maniera più ampia possibile con le tecnologie attualmente disponibili, gli eventi transcrizionali, compresi quelli relativi agli small RNA (non affrontati nella presente tesi), metabolici, su un subset di metaboliti primari e secondari, e ormonali, tramite un approccio di hormone profiling, che si verificano durante lo sviluppo della mela. La presente tesi è organizzata in diversi capitoli, riflettendo la logica sperimentale e temporale effettivamente seguita per sviluppare le ricerche. Lo scopo principale del lavoro qui presentato è quello non solo di fornire una panoramica di informazioni su trascritti, ormoni e metaboliti e le loro variazioni durante lo sviluppo del frutto, ma anche di proporre delle soluzioni tecniche e sperimentali per poter collocare le informazioni acquisite in una piattaforma integrativa, secondo la logica della systems biology. Nelle specie modello, tutto ciò è fortemente facilitato dall’ampia disponibilità di tool bioinformatici pronti all’uso ma non sufficientemente flessibili per poter essere adattati ad altre specie. Tuttavia, soprattutto per quanto riguarda soprattutto le specie arboree da frutto, questo tipo di approccio è ancora lontano dell’essere definito e standardizzato. Il Capitolo 1 introduce l’argomento “sviluppo della mela” in relazione all’adozione del melo come specie arborea modello, in misura sempre più crescente soprattutto nell’ultimo decennio grazie anche alla disponibilità della sequenza del genoma. Dopo un excursus sulle principali e più recenti acquisizioni relative allo sviluppo del frutto del melo, vengono discusse alcune delle principali criticità e lacune, sia dal punto di vista tecnologico che scientifico, che impediscono una visione completa degli eventi regolativi che coordinano lo sviluppo e la crescita della mela, anche in relazioni ai principali parametri qualitativi e produttivi. Nel Capitolo 2 si inizia ad entrare nel merito delle ricerche, illustrando la fase preparativa di ricerca e validazione multipla (tra cultivar diverse e annate diverse) di marcatori trascrizionali delle fasi di sviluppo del frutto indirizzate alla corretta selezione di campioni rappresentativi in serie temporali raccolte in annate differenti. Sono stati identificati, validati ed utilizzati diversi marcatori fra quelli proposti in letteratura, consentendo la selezione dei campioni di cv Golden Delicious (qui usata come modello) da utilizzare nelle successive fasi di caratterizzazione trascrizionale e metabolomica condotte nelle tesi. Nel Capitolo 3 si affronta il primo importante studio dei profili ormonali durante lo sviluppo del frutto. I risultati acquisiti hanno consentito non solo di acquisire dati relativi alla maggior parte degli ormoni da poter utilizzare in ricerche future, ma anche di chiarire, confermare e/o ipotizzare delle interazioni ormonali in funzione dello stadio di sviluppo o della transizione tra stadi diversi. La peculiarità di questo studio consiste nell’aver ottenuto, per la prima volta nel melo, dati quantitativi di un set importante di ormoni a partire dagli stessi campioni. Il Capitolo 4 affronta invece la questione relativa ai metaboliti e alle loro variazioni nel corso dell’intero sviluppo del frutto. Viene in questo modo fornita una visione complessiva di come variano le diverse classi di metaboliti (principalmente zuccheri, acidi organici, amminoacidi e polifenoli) durante lo sviluppo. Anche in questo caso i dati sono stati acquisiti dagli stessi campioni utilizzati negli altri capitoli per le altre tipologie di analisi e potranno essere impiegati in ricerche successive, ad esempio, in una logica integrativa, insieme a dati trascrittomici di diversa natura, epigenetici, ecc. Nel Capitolo 5, finalmente, la tesi si addentra fra mille difficoltà tecniche, poi in parte superate, nella giungla della cosiddetta systems biology, fornendo un esempio di come i dati ormonali possono essere valorizzati attraverso la loro integrazione con i dati trascrittomici ottenuti tramite RNAseq a partire dagli stessi campioni.