Chronic lung allograft dysfunction: clinical and experimental study

INTRODUCTION Transplantation is the only effective treatment for several end-stage lung diseases. Remarkable progress has been made in improving outcomes, although the 5-year graft survival is still less than 50% primarily because of the development of chronic lung allograft dysfunction (CLAD). CLAD has been now recognized as a heterogeneous condition that includes an obstructive form (bronchiolitis obliterans syndrome, BOS) and a restrictive allograft dysfunction (restrictive allograft syndrome, RAS). BOS, and its histological correlate obliterative bronchiolitis -OB- represents the principal form of CLAD (~75%). The specific etiology and pathogenesis of BOS/OB are not fully understood. Multiple immune mechanisms seem to contribute to the development of BOS/OB, thus it is thought to represent a final common pathway of a process triggered by both alloantigen dependent and independent mechanisms. While the role of alloimmunity has long been established more recent studies have begun to demonstrate the role of autoimmunity in the development of BOS. A few experimental and clinical studies have demonstrated that collagen V and K-α1 tubulin, modified during ischemia reperfusion injury, may trigger autoimmune response, both humoral and cell mediated. Interleukin 17 (IL17), a proinflammatory cytokine involved in autoimmune and infectious diseases, has recently been suggested to play a key role in the development of CLAD. The development of animal models, mimicking the human transplantation procedure, is of great importance to elucidate the pathogenetic mechanisms leading to BOS/OB, to identify important biomarkers of OB and finally to test the effectiveness of new target therapies. However up to today two important issues are largely discussed in rodent orthotopic models: 1) the reproducibility of the surgical procedure 2) the identification of the best genetic strain (inbred versus outbred rats) for the development of immunological lesions similar to those in humans. AIM OF THE RESEARCH The main goals of the present PhD research project were: 1) development of a reproducible orthotopic lung transplant animal model, obtaining immunological lesions, particularly CLAD, similar to those of humans; 2) evaluation of IL17/IL23 pathway, crucial in autoimmune response, through a careful investigation in preclinical models and in clinical index cases of CLAD. MATERIALS AND METHODS Two different animal models were used to perform orthotopic lung transplantation (OLT): outbred rat strain (20 CD SPF left lungs were transplanted into VAF) and inbred rat strain (32 Lewis left lung rats were transplanted into Fisher 344). Only the long term survival animals (sacrificed 30 and 90 days after LT) were subjected to a full immunological evaluation as follows: a) detection of donor-specific antibodies (DSA) testing serum samples with the flow cross match technique b) morphological and immunophenotype evaluation of acute and chronic immunological lesions developed in the graft c) immunohistochemical and molecular (RT-qPCR) analysis of IL17/IL23 pathway in the graft and bronchoalveolar lavage (BAL) of animals and in all scheduled transbronchial biopsies of two index cases that developed CLAD. RESULTS Surgical mortality and early graft failure (within 24 hours) was higher in the outbred than inbred group (only 2 of a total 20 outbred rats survived). The two survival OLT outbred rats (sacrified 13 and 14 days after OLT) developed well evident immunological disorders: one showed acute cellular rejection (ACR) with coexistent early OB and the other late OB. Immunological disorders (only minimal ACR: A1B1) were rare (only 1/11; 9%) in the first 15 days of OLT inbred rats. In this period the inbred grafts showed ischemia/reperfusion or infections. ACR (≥A2B1) developed in 2/6 (33%) inbred grafts at 30 days. Ninety days after OLT was the best time point for the development of immunological disorders: ACR (≥A2B1) and OB (both early and late) were detected in 7/15 (46%) and 8/15 (53%) animals respectively, regardless of immunosuppressive treatment. DSA IgG showed higher median levels in those with ACR or OB than those without (70% and 34%, respectively vs 13%). A strong IL17 immunostaining was detected in inbred grafts that developed ACR and OB. IL 17 was equally expressed in inflammatory cells (macrophages and lymphocytes) of inbred grafts with ACR and OB while it was more expressed in epithelial and endothelial cells of inbred grafts with OB. No staining was detected in grafts of animals without any sign of rejection. IL23 expression was high in grafts with both absence and presence of rejection. Molecular analysis of IL17 and IL23 expression in BAL fluids showed higher levels of mRNA in grafts with ACR than OB. All scheduled transbronchial biopsies of the two index cases with ACR and OB showed IL17 overexpression with the same pattern detected in the preclinical model. CONCLUSIONS Outbred rodents that could have been more similar to humans due to high genetic diversity can not be used as a reliable OLT model because of the high rate of dramatic early graft failure. A reproducible model of both ACR and OB was developed in inbred rats (Lewis to Fisher 344) and 90 days post-transplantation was the optimal endpoint established. IL17, overexpressed in ACR and overall in OB lesions, is a crucial mediator in post-transplant immunological lesions and could be considered a potential therapeutic target in clinical transplantation.

INTRODUZIONE Il trapianto di polmone è l’unica opzione terapeutica per alcune patologie polmonari terminali. Notevoli progressi sono stati fatti in questo ambito, tuttavia la sopravvivenza dell’organo dopo 5 anni è inferiore al 50%, principalmente a causa dello sviluppo del rigetto cronico. Il rigetto cronico si presenta in modo eterogeneo, in quanto può essere caratterizzato da una forma ostruttiva (sindrome della bronchiolite obliterante, BOS) o da una restrittiva (RAS). La BOS e il suo corrispondente aspetto istopatologico, la bronchiolite obliterante (BO), rappresentano la principale forma di rigetto cronico (~75%). L’eziologia e l’esatta patogenesi della BOS/BO non sono ancora state completamente chiarite in quanto diversi meccanismi immunitari sembrano essere coinvolti nel suo sviluppo e sembra essere la conseguenza di un processo indotto da meccanismi dipendenti/indipendenti dagli alloantigeni. Infatti, il ruolo dell’alloimmunità nello sviluppo della BOS/BO è stato dimostrato da tempo, mentre quello dell’autoimmunità è emerso solo recentemente. Pochi lavori sperimentali e clinici hanno dimostrato che il collagene V e la tubulina K-α1, modificati nel danno da ischemia e riperfusione, possono indurre la risposta autoimmune, sia umorale che cellulo-mediata. L’interleuchina17 (IL17), una citochina proinfiammatoria coinvolta in patologie autoimmuni ed infettive, è stata proposta recentemente come fattore cruciale nello sviluppo del rigetto cronico. Lo sviluppo di modelli animali, che subiscono una procedura trapiantologica analoga all’umana, risulta di grande importanza al fine di chiarire i meccanismi patogenetici legati allo sviluppo della BOS/BO, di identificare biomarcatori precoci e di provare l’efficacia di nuove terapie. Attualmente, due importanti aspetti vengono largamente discussi nei modelli di trapianto ortotopico nei roditori: 1) la riproducibilità della procedura chirurgica e 2) l’identificazione del migliore genotipo (inbred o outbred) per lo sviluppo di lesioni immunologiche simili a quelle umane. SCOPO DELLA RICERCA I principali obiettivi di questa ricerca sono stati: 1) sviluppo di un modello animale di trapianto ortotopico di polmone riproducibile con lesioni immunologiche simili a quelle umane, in particolare quelle tipiche del rigetto cronico; 2) verificare l’ipotesi che IL17/IL23 giochi un ruolo chiave nello sviluppo del rigetto cronico mediante uno studio scrupoloso nei modelli preclinici e in casi clinici emblematici. MATERIALI E METODI Due modelli animali sono stati utilizzati per eseguire il trapianto ortotopico di polmone (LT): il modello outbred (20 polmoni sinistri CD SPF sono stati trapiantati in VAF) e il modello inbred (32 polmoni sinistri di ratti Lewis sono stati trapiantati in Fisher 344). Esclusivamente i ratti con sopravvivenza a lungo termine (sacrificati 30 e 90 giorni dopo LT) sono stati studiati in modo approfondito dal punto di vista immunologico mediante: a) ricerca di anticorpi anti-donatore (DSA) mediante citometria a flusso sui campioni ematici; b) valutazione morfologica ed immunofenotipica di lesioni immunologiche acute e croniche sviluppatesi nel polmone trapiantato; c) analisi immunoistochimica e molecolare (PCR semiquantitativa) del meccanismo IL17/IL23 nell’organo trapiantato e nel BAL dei modelli animali e nelle biopsie transbronchiali di monitoraggio di due casi clinici emblematici di pazienti che hanno sviluppato la BO. RISULTATI La mortalità perioperatoria e la disfunzione precoce dell’organo trapiantato (entro le 24 ore) erano più elevate nel gruppo di animali outbred rispetto agli inbred (solo 2/20 ratti outbred sono sopravvissuti): uno presentava rigetto cellulare acuto (ACR) con coesistente BO precoce, l’altro un rigetto cronico tardivo. Nei primi 15 giorni dopo LT i topi inbred presentavano raramente lesioni immunologiche (solo 1/11: 9%) e si trattava di ACR lieve (A1B1). In questo periodo i polmoni trapiantati inbred mostravano danno da ischemia/riperfusione o infezioni. In 2/6 (33%) dei polmoni trapiantati inbred è stato riscontrato un importante ACR (≥A2B1) 30 giorni dopo LT. Il sacrificio a 90 giorni è risultato ottimale per lo sviluppo di lesioni immunologiche: ACR (≥A2B1) e BO (lesioni precoci e tardive) sono state riscontrate in 7/15 (46%) e 8/15 (53%) animali rispettivamente, indipendentemente dal trattamento di immunosoppressione. Gli animali con ACR o BO presentavano livelli di Ig DSA maggiori rispetto a quelli che non presentavano alcun segno di rigetto (rispettivamente 70% e 34% vs 13%). Una forte positività immunoistochimica per IL17 è stata riscontrata nei polmoni trapiantati dei topi inbred che avevano sviluppato ACR e BO. Non erano evidenti differenze significative nell’espressione di IL17 nelle cellule infiammatorie (macrofagi e linfociti) di polmoni inbred con ACR e BO, mentre è risultata maggiore nelle cellule epiteliali ed endoteliali di polmoni inbred con BO rispetto a quelli con ACR. Non è stata riscontrata positività nei polmoni di animali senza alcun segno di rigetto. L’espressione di IL23 era elevata sia in assenza che in presenza di rigetto. L’analisi molecolare dell’espressione di IL17 e IL23 nel BAL ha dimostrato maggiori livelli di mRNA nei polmoni trapiantati con ACR rispetto a quelli con BO. Tutte le biopsie di monitoraggio dei due casi emblematici caratterizzate da ACR e BO hanno mostrato un’elevata espressione di IL17 con lo stesso pattern riscontrato nel modello preclinico. CONCLUSIONI I ratti outbred, che potrebbero essere considerati più simili all’uomo data la loro diversità genetica, non possono essere considerati un modello riproducibile di LT a causa dell’elevata mortalità precoce. E’ stato sviluppato un modello riproducibile di rigetto acuto cellulare e cronico nei ratti inbred (da Lewis a Fisher 344) e il sacrificio 90 giorni dopo il trapianto è risultata la tempistica ottimale. IL17, notevolmente espressa nell’ACR e nella BO, è un mediatore cruciale nelle lesioni immunologiche post-trapianto e potrebbe rappresentare un importante target terapeutico nella trapiantologia clinica.