Sviluppo e caratterizzazione di nuovi inibitori diretti contro la polimerasi dei virus dell'influenza di tipo A e B

Influenza (flu) is an airborne highly-infectious disease, characterized by high morbidity and significant mortality, especially in at-risk population (young children, elderly people, patients with chronic disease). Influenza type A (IAV) and type B (IBV) viruses, characterized by remarkable genetic instability and antigenic variability, are responsible for seasonal epidemics, which affect every year 15-20% of the world population. In addition, IAV is able to infect a wide variety of birds and mammals and as happened with the recent case of H1N1 swine flu, a genetic reassortment between viral genomic segments of different species may occur and cause pandemics. During the past century, the pandemics of Spanish flu (1918), Asian flu (1957) and Hong Kong flu (1968) caused millions of deaths worldwide. For these reasons IAV and IBV pose a large threat to public health and it is absolutely necessary have therapeutic agents effective against these viruses. The therapeutic options currently available for influenza include vaccination and two distinct classes of anti-influenza drugs represented by the NA inhibitors and the M2 ion channel blockers. However, vaccines need to be reformulated each year due to the genetic variability of the virus and are not always protective. In addition, the production of a new vaccine takes several months, so it is highly unlikely that vaccination may be effective in preventing the spread of a rapidly emerging influenza pandemic. Oseltamivir (tamiflu) and zanamivir (relenza) are NA inhibitors and act by blocking the release of the viral particle from infected cells. Amantadine (symadine, symmetrel) and rimantadine (Flumadine) block the ion channel of the M2 protein, preventing viral uncoating and thus the release of genomic segments in the cytoplasm. These drugs, however, have several drawbacks, including considerable side effects, limited efficacy, significant limitations of administration and above all they are associated with a rapid emergence of drug-resistant viral strains. In fact, there no an effective antiviral therapy against influenza and thus there is a strong need for the development of new anti-influenza compounds, possibly endowed with an innovative mechanism of action. An interesting target for the development of novel anti-influenza strategies is represented by the viral RNA polymerase; in fact, the influenza virus polymerase is a conserved element among different viral strains, as it is not subjected to genetic variability. The influenza virus RNA polymerase is a heterocomplex which consists of three proteins (polymerase acid protein [PA], polymerase basic protein 1 [PB1] and polymerase basic protein 1 [PB2]). The three polymerase subunits interact each other, in particular PB1 interacts with PB2 and PA, while at the moment there is little evidence of an interaction between PB2 and PA. It has been shown that the PA/PB1 interaction is crucial for influenza virus replication: in fact, the inhibition of this interaction result in the inhibition of viral polymerase activity. The fact that the interface of PA-PB1 interaction is highly conserved among different IAV and IBV strains and that this interaction is essential for viral replication makes it a potential target for the development of novel anti-influenza compounds with broad-spectrum activity. Thanks to an in silico screening of a virtual library of small molecules, performed by our research group, we have identified a few compounds able to dissociate the interaction between PA and PB1 in vitro, at micromolar concentrations (Muratore et al., 2012a). The same compounds showed no cytotoxicity in cell lines, but at the same time exhibited only modest antiviral activities against IAV. The purpose of this project was to evaluate the binding modes of these compounds with the target and based on this information to design structural analogues, in order to increase the antiviral activity, preserving the absence of cytotoxicity and their peculiar mechanism of action. Once synthesized, these analogues have been tested in various experiments, in order to assess their ability to inhibit viral replication of IAV in plaque reduction assays (PRA), but also to determine their inhibitory effect on PA-PB1 interaction in ELISA and to investigate their possible cytotoxicity on cell lines in MTT assays. Among these, the compounds 70, T22 and T40 showed inhibitory effects on viral polymerase activity, with EC50 values comparable or even lower than that obtained with ribavirin (RBV), used as reference drug. Then, we also evaluated the antiviral activity of these analogues over the time; what emerged is that all compounds show a maximum of activity at 12 h post-infection (p.i.), but they still maintain the antiviral effects at 48 h pi. Moreover, the most promising analogues were able to inhibit the replication of a panel of several strains of IAV and IBV, including an oseltamivir-resistant clinical isolate, thus demonstrating to have anti-influenza broad-spectrum activity. In contrast, the same compounds showed no inhibitory effect on the replication of other DNA and RNA viruses, confirming to possess a specific mechanism of action. Finally, for some promising analogues, we made predictions and simulations of virtual interaction with the cavity of PA as well as studies to assess the possible variation of inhibitory activity against mutated PA targets in some key residues as compared to the wild-type (wt) PA. This has allowed us to delineate the structure-activity relationships (SAR) and to understand the binding modes of these inhibitors, obtaining useful suggestions for the design of new analogues characterized by a better fit into the PA cavity and thus a more potent antiviral activity. In conclusion, this study demonstrates the potential of these compounds as inhibitors of influenza virus RNA polymerase, which will be tested in next future in combinations with current anti-Flu drugs in order to evaluate possible synergistic effects. In addition, this work has led to the identification of a series of new scaffolds endowed with antiviral activity that will be further studied to develop a new generation of therapeutic agents capable to fight the infection by IAV and IBV.

L’influenza è un’infezione respiratoria, di origine virale, caratterizzata da elevata morbidità e mortalità soprattutto in soggetti ad alto rischio (bambini, anziani, pazienti con malattie croniche/debilitanti, ecc.). I virus influenzali di tipo A (IAV) e di tipo B (IBV), caratterizzata da notevole instabilità genetica e variabilità antigenica, sono la causa di epidemie annuali che colpiscono ogni anno il 15-20% della popolazione mondiale. Inoltre IAV è in grado di infettare una grande varietà di uccelli e mammiferi e come accaduto con il recente caso di influenza suina H1N1, un riassortimento genico tra i segmenti genomici virali di differenti specie può verificarsi e causare anche pandemie. Nel secolo scorso, la pandemie di influenza spagnola (1918), l’influenza asiatica (1957) e l’influenza di Hong Kong (1968), hanno causato effetti devastanti, determinando diverse decine di milioni di morti in tutto il mondo. Per questi motivi IAV e IBV rappresentano una grave minaccia per la salute pubblica ed è assolutamente necessario disporre di agenti terapeutici efficaci contro questi virus. Le opzioni terapeutiche attualmente disponibili contro l’influenza includono la vaccinazione e due distinte classi di farmaci rappresentati dagli inibitori di neuraminidasi (NA) e dai bloccanti del canale ionico M2. Tuttavia i vaccini devono essere riformulati ogni anno a causa della variabilità genetica del virus e non sono sempre protettivi. Inoltre, la produzione di un nuovo vaccino richiede vari mesi, quindi è del tutto improbabile che la vaccinazione possa essere efficace nell’impedire la diffusione di una pandemia influenzale rapidamente emergente. Oseltamivir (tamiflu) e zanamivir (relenza) fanno parte degli inibitori di neuraminidasi ed agiscono bloccando il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate. Amantadina (symadine, symmetrel) e rimantadina (flumadine) invece vanno a bloccare il canale ionico della proteina M2, prevenendo la transcapsidazione del virus e quindi il rilascio dei segmenti genomici nel citoplasma. Questi farmaci tuttavia presentano numerosi svantaggi, tra cui considerevoli effetti collaterali, efficacia ridotta, notevoli limitazioni nella somministrazione e soprattutto sono associati ad una rapida emergenza di ceppi virali farmaco-resistenti. Di fatto, non esiste ancora una terapia efficace contro l’influenza e questo rende necessario lo sviluppo di nuovi farmaci, possibilmente dotati di un innovativo meccanismo d’azione. Un interessante bersaglio per lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali è rappresentato dall’RNA polimerasi virale, in quanto è un elemento conservato fra i diversi ceppi virali e non è soggetto a riassortimento genico. L’RNA polimerasi virale è un complesso eterotrimerico, costituito da tre proteine (la proteina acida della polimerasi [PA], la proteina basica 1 della polimerasi [PB1] e la proteina basica 2 della polimerasi [PB2]). Queste tre subunità interagiscono fisicamente tra di loro e, in particolare, la subunità PB1 interagisce sia con PB2 che con PA, mentre al momento esistono evidenze di un’interazione tra PB2 e PA. E’ stato dimostrato che l’interazione PA/PB1 è essenziale per la replicazione del virus: infatti l’inibizione di questa interazione causa l’inibizione della polimerasi virale. Il fatto che l’interfaccia di interazione PA-PB1 sia molto conservata tra differenti ceppi di IAV e IBV e che questo legame sia essenziale per la replicazione virale fa sì che esso rappresenti un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi composti anti-influenzali ad ampio spettro. Grazie ad uno screening in silico di una libreria di strutture di small molecules, condotto dal nostro gruppo di ricerca, sono stati identificati alcuni composti in grado di dissociare l’interazione tra le subunità PB1 e PA della RNA polimerasi del virus dell’influenza in vitro, a concentrazioni micromolari (Muratore et al., 2012a). Gli stessi composti non mostravano citotossicità in linee cellulari, ma allo stesso tempo esibivano solo modeste attività antivirali contro IAV. Lo scopo di questo progetto è stato valutare le modalità di interazione di questi composti con il bersaglio e sulla base di queste informazioni disegnare degli analoghi strutturali per aumentarne l’attività antivirale, preservando allo stesso tempo l’assenza di citotossicità ed il peculiare meccanismo d’azione. Una volta sintetizzati, questi analoghi sono stati saggiati in vari esperimenti al fine di valutarne appunto la loro capacità di inibire la replicazione virale di IAV mediante saggi di riduzione delle placche (plaque reduction assays, PRA), ma anche determinare il loro effetto inibitorio sull’interazione PA-PB1 in saggi ELISA ed indagare sulla loro eventuale citotossicità su linee cellulare in saggi MTT. In questi saggi, alcuni analoghi si sono messi in luce mostrando delle promettenti attività inibitorie e sono stati selezionati per essere ulteriormente caratterizzati. L’attività dei composti più interessanti è stata confermata mediante minireplicon assay, un saggio cellulare che permette di determinare l’effetto delle molecole sull’attività polimerasica di IAV. Tra questi, i composti 70, T22 e T40 hanno mostrato un effetto inibitorio sull’attività polimerasica virale con valori di EC50 comparabili o addirittura minori a quello ottenuto con la ribavirina (RBV), utilizzata come farmaco di riferimento. E’ stata poi valutata anche l’attività antivirale di questi analoghi nel tempo; quello che è emerso è che tutti i composti mostravano un massimo di attività alle 12 ore post-infezione (p.i.), senza tuttavia perdere l’effetto antivirale neanche a 48 ore p.i. Inoltre gli analoghi più promettenti erano capaci di inibire la replicazione di un pannello di diversi ceppi di IAV e di IBV, incluso un isolato clinico oseltamivir-resistente, dimostrando così di avere un’attività anti-influenzale ad ampio spettro. Al contrario, gli stessi composti non hanno evidenziato alcun effetto inibitorio sulla replicazione di altri virus a DNA e RNA, confermando di possedere uno specifico meccanismo d’azione. Infine per alcuni analoghi promettenti sono stati eseguite delle previsioni e delle simulazioni virtuali di interazione con la cavità di PA ed anche studi in cui è stata valutata l’eventuale variazione o meno di attività inibitoria nei confronti del bersaglio di PA mutato in alcuni residui chiave rispetto a quello wild-type (wt). Questo ci ha permesso di delineare delle relazioni struttura-attività (structure-activity relationships, SAR) e di ottenere preziose informazioni riguardo al modo in cui questi inibitori interagiscono con PA, ricavando di conseguenza utili suggerimenti per il disegno di nuovi analoghi caratterizzati da un miglior adattamento alla tasca di legame e da un’attività ancor più potente. In conclusione, questo studio dimostra le potenzialità di questi composti come inibitori dell’RNA polimerasi dei virus influenzali e nel prossimo futuro saranno saggiati in combinazione con i farmaci anti-influenzali attualmente in commercio per valutare possibili effetti sinergici. Inoltre questo lavoro ha permesso di identificare nuovi scaffold dotati di attività antivirale che saranno ulteriormente studiati per sviluppare una nuova generazione di agenti terapeutici capaci di combattere l’infezione da IAV e IBV.