Mechanisms of CNS infiltration in T-cell leukemia: a molecular study of zebrafish and mouse models

In 1970s, the introduction of presymptomatic central nervous system (CNS) therapy changed the prognosis of pediatic Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). Before that, more than half of complete remissions obtained with systemic chemotherapy experienced CNS relapse. The contemporary use of risk-directed treatment has improved 5-year event-free survival to rates about 80% for childhood ALL. However, still CNS relapse remains an important cause of mortality occurring in about 3-8% of ALL patients. Recent clinical trials focus in reducing CNS relapse with the use of individualized therapy that can avoid both over- and under-treatment. Moreover, several studies aim to minimize secondary negative effects related to use of cranial irradiation, a treatment still recommended for ALL children at high risk of CNS relapse (i.e: patients with CNS leukemia at diagnosis or T-immuniphenotype with high White Blood Cell (WBC) count). This project aims to deep insight into the mechanisms used by blast cells to infiltrate the CNS. We focused on T-ALL as in this leukemia the phenomenon of CNS disease is more recurrent than in B-ALL. To identify conserved molecular mechanisms that could be at the basis of CNS infiltration we started the analysis on animal models to move subsequently to human patients. To goal in this aim we used a gene expression profiling (GEP) approach. Chapter 1 reports a study performed on two zebrafish models both developing T-ALL but that are genetically different; hMYC-ER line overexpresses human C-MYC, while hlk model carries an unknown mutation. We demonstrate for the first time that both these zebrafish model can mimic the phenomenon of CNS disease in T-ALL. Moreover, we found a different predisposition for hMYC-ER and hlk cancers to infiltrate the CNS. A whole transcriptome analysis of hMYC-ER and hlk T-ALL helped us to identify different molecular mechanisms that could control motility of blast cells. Particularly, we identified on cxcr4/cxcl12 axis, an important mechanisms that could predispose T-lymphoblasts to infiltrate the CNS environment. In fact, we found a positive correlation between cxcr4 expression levels and seriousness of CNS infiltration. The importance of CXCR4/CXCL12 axis in determining extramedullary infiltration is still debated, as studies on pediatric ALL patients reveal conflicting results. In Chapter 2, we investigated the association of CXCR4/CXCR4 expression and CNS infiltration, using murine models xenoengrafted with human patients T-ALL cells. Also in this animal model we found diverse degree of CNS infiltration on xenografted mice derived by different human patients. Preliminary results seem to confirm that higher levels of CXCR4 expression favour the migration of T-lmphoblasts towards the CNS environment. Further analyses of validation are ongoing on a larger cohort. In Chapter 3 we switch to study the phenomenon of CNS infiltration on ALL patients. GEP analysis was used to compare patients with (CNS+) or without (CNS-) disease. However, this approach on human patients failed to find a strong signature that could identify CNS+ and CNS- patients. This result underlines the difficulty to study this phenomenon directly on human patients, as a high heterogeneity is present inside both T- and B-ALL group. Moreover, we could not find an association between CXCR4 expression and CNS infiltration in a T-ALL cohort and that stress the idea that blasts cells can use different mechanisms to infiltrate the CNS and the high expression of CXCR4 might be a predisposing factor that requires interaction with others mechanisms. T-test analysis performed on zebrafish gene expression results revealed a significant different gene expression profile existing inside the zebrafish group overexpressing hCMYC (hMYC-ER). This observation challenges us to clarify the importance and the role of C-MYC oncogene in T-ALL leukemogenesis. In Chapter 4 we were able to find a strong signature insight the group of patients with high expression of C-MYC that can discriminate patients with- and without- C-MYC rearrangements. In both Chapter 4 and 5 we tested the ability of gene expression profiling approach in identifying signature within specific subgroup of T-ALL patients. In fact also in Chapter 5 we showed the presence of a gene expression profile that characterize patients carrying MLLT10 rearrangements inside the HOXA category of pediatric T-ALL.

Fino agli anni '70, la prognosi dei pazienti con Leucemie Linfoblastiche Acute (LAL) e coinvolgimento del SNC era particolarmente infausta. Infatti circa il 70% dei pazienti presentava una ricaduta con coinvolgimento del SNC. L'introduzione di terapie mirate alla prevenzione/trattamento delle infiltrazioni blastiche nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) all'inizio degli anni '80 ha rivoluzionato il decorso clinico dei pazienti con ricaduta LAL e coinvolgimento del SNC. Attualmente, le ricadute LAL nel SNC rappresentano circa il 3-6% di tutte le ricadute e questo miglioramento si può ricondurre all'identificazione precoce dei pazienti ad alto rischio di ricaduta e all'uso di terapie specifiche per diverse categorie di rischio, che complessivamente, hanno permesso di raggiungere un tasso di guarigione che va oltre l'80%. Tuttavia, le ricadute nel SNC continuano ad essere un'importante causa di mortalità soprattutto in età pediatrica. Recentemente, numerosi trials clinici stanno cercando di ridurre il tasso di incidenza delle ricadute LAL che coinvolgono il SNC, attraverso l'uso di terapie individuali che permettano di evitare il sovra- o il sotto-dosaggio di chemioterapico per il paziente. Inoltre, molti studi stanno cercando di minimizzare gli effetti negativi dovuti all'uso di radioterapia, un trattamento ancora raccomandato nella cura delle LAL pediatriche ad alto rischio di ricaduta nel SNC (i.e. pazienti con infiltrazione del SNC già alla diagnosi o on LAL di tipo T associata ad un'alta conta di globuli bianchi). In questa tesi, abbiamo impiegato lo studio del profilo di espressione genica al fine di individuare i possibili meccanismi molecolari che consentano alle cellule leucemiche di infiltrare il SNC, utilizzando due differenti modelli animali: zebrafish e topi NSG. I processi biologici identificati sono stati quindi validati in una corte di pazienti pediatrici alla diagnosi con leucemia limfobalstica acuta. Ci siamo focalizzati in particolar modo sulle LAL di tipo T, poiché in questo tipo di leucemie il coinvolgimento del SNC è più ricorrente rispetto alle LAL-B sia alla diagnosi che alla ricaduta. Il capitolo 1 riporta uno studio effettuato su due modelli di zebrafish geneticamente differenti, in grado di riprodurre la LAL-T. La linea transgenica hMYC-ER sviluppa una leucemia LAL-T indotta dalla sovraespressione del gene umano C-MYC, mentre il modello zebrafish hkl è stato ottenuto tramite mutagenesi chimica non specifica. In questo studio, abbiamo dimostrato come entrambe queste linee modello riescano a riprodurre il fenomeno dell infiltrazione delle cellule blastiche nel SNC con diverso grado di invasione a seconda del tipo di modello considerato. L'analisi dell'intero trascrittoma delle cellule leucemiche estratte dai due modelli di zebrafish, ci ha permesso di identificare diversi meccanismi molecolari che possono regolare la migrazione e l'infiltrazione delle cellule tumorali. In particolare, l'attivazione dell'asse cxcr4/cxcl12 sembra conferire ai linfoblasti T una maggiore capacità di infiltrazione del SNC nel modello hMYC-ER, come dimostrato dalla sua maggiore invasivita nel SNC, rivelando una correlazione diretta tra l'over-espressione del cxcr4 e il grado di invasione. Nel capitolo 2, abbiamo studiato l'associazione tra espressione del CXCR4 e l'infiltrazione del SNC in topi xenotrapiantati con cellule LAL-T provenienti da pazienti pediatrici. Risultati preliminari sembrano confermare la correlazione tra alti livelli di espressione del CXCR4 e l'aumentata migrazione dei linfoblasti T nel SNC. Attualmente ulteriori analisi sono in corso, con lo scopo di validare la relazione "espressione CXCR4-infiltrazione del SNC" in una coorte più ampia. Nel capitolo 3, considerando i risultati precedentemente ottenuti, abbiamo analizzato il profilo di espressione genica di pazienti pediatrici alla diagnosi di leucemia linfobalstica acuta con (SNC+) o senza (SNC-) coinvolgimento del SNC. Questo approccio non ha portato all'identificazione di una signature in grado di distinguere i due gruppi considerati e questo risultato è in parte dovuto al basso numero di pazienti analizzati con SNC+ e all'alta eterogenicità genetica presente all interno della corte studiata. La mancanza di una diretta correlazione tra l'espressione del CXCR4 e l'infiltrazione nel SNC nei pazienti LAL-T suggerisce che più meccanismi molecolari possano cooperare per regolare il movimento delle cellule leucemiche e determinarne la capacità di infitrare tessuti extra-midollari. L'alta espressione del CXCR4 potrebbe essere un fattore di predisposizione che tuttavia richiede l'interazione con altri meccanismi per consentire ai linfoblasti-T di entrare nel SNC. Nel capitolo 4 ci siamo focalizzati sul significato biologico della diversa espressione del gene C-MYC in pazienti LAL-T in relazione alla varie aberrazioni genetiche che possono modulare l'espressione di questo oncogene. Tramite l'analisi dell'espressione genica abbiamo individuato una specifica signature in grado di distinguere pazienti con over espressione e riarrangiamenti citogenetici del gene C-MYC. Abbiamo successivamente analizzato il profilo di espressione genica di pazienti LAL-T con riarrangiamenti citogentici HNRNPH1-MLLT10 e DDX3X-MLLT10 per determinare se questo sottogruppo di pazienti presentava caratteristiche comuni ad altri pazienti con riarrangiamenti del gene MLLT10 all'interno della categoria HOXA. Attraverso questo studio abbiamo dimostrato i vantaggi legati all'analisi del profilo di espressione genica per l'identificazione di particolari signatures che vadano a distinguere dei sottogruppi all'interno di specifiche categorie di pazienti affetti da LALT. Lo studio ha permesso inoltre, attraverso l'utilizzo in due diversi modelli animali, di identificare comuni specifici meccanismi molecolari legati all'infiltrazione delle cellule blastiche nel sistema nervoso centrale.