Concentrazione plasmatica e produzione extrapineale di melatonina nel tursiope (Tursiops truncatus)

Melatonin is a ubiquitous hormone, produced both by vertebrates and invertebrates, including also bacteria and protozoans, besides superior plants. Its main role is to regulate biological rhythms, thanks to a secretion pattern reflecting the daily light-dark cycle, determining so-called circadian rhythms. Over the year, this daily rhythm changes slightly but constantly with changing daylength, generating a circannual or seasonal rhythm. Circulating melatonin in mammals is synthesized by the pineal gland (or epiphysis cerebri), a neuroendocrine structure situated on the roof of the third ventricle, belonging to the diencephalon. This gland in cetaceans is apparently absent, though there are controversial reports in the literature, some reporting its presence. In some species yet, some authors found it in some individuals, whereas other studies on conspecifics did not detect it. This is the case also for the common bottlenose dolphin (Tursiops truncatus), the subject of this study. The aim of the present research is to assess some aspects of melatonin production, which has never been investigated in this species, from different point of views, macroscopic, physiological and biomolecular. First, the presence of a pineal gland was evaluated in a series of bottlenose dolphin brains, all of which unfortunately lacked one. To verify if melatonin was produced all the same, blood samples were collected from two groups of captive bottlenose dolphins in two different locations, over a 7 month period. Hormone concentration was determined by a validated radioimmunoassay (RIA), revealing for the first time the actual presence of melatonin in the blood, with little seasonal and daily fluctuations. The significance of these variations was somewhat limited due to the impossibility to cope with the scheduled sampling design, obtaining a much lower sample size than expected. Since the pineal is apparently absent in bottlenose dolphins, but its main product is actually found in the blood of this species, melatonin synthesis by alternative sources was investigated. In the literature, extrapineal melatonin production is well documented in some tissues, though their relative contribution to circulating levels has still to be elucidated. In mammals the three main extrapineal sites are the retina, the Harderian gland and the gastro-intestinal tract. The presence of the enzyme hydroxyindole-O-methyl-transferase (HIOMT), the last one of melatonin biosynthetic pathway, was investigated by immunohistochemistry. Bovine pineal glands were used as a positive control. All the three tissues were positively labeled, though with some differences with respect to most mammals. To confirm HIOMT presence in immunoreactive tissues, the presence of its mRNA was evaluated through PCR. Since there are currently no cetacean sequences of the enzyme, five different primer couples were designed, one on the known bovine sequence, the others on the bottlenose dolphin predicted sequence available on the ENSEMBL genome database. None of them unfortunately gave positive results, even in the immunoreactive tissues, prompting the need in future studies to characterize the HIOMT gene of the bottlenose dolphin, so to obtain the correct sequence and to design specific primers. A further aspect concerning melatonin production in the bottlenose dolphin was the possible use of an in vivo model alternative to that of the whole animal, i.e. cell cultures. Since in the literature melatonin production was demonstrated in the skin of some mammalian species, and since skin samples are the easiest to obtain during a cetacean necropsy, primary cell cultures were established from bottlenose dolphin cutaneous specimens. After stabilizing them by an immortalization process, the cultures were characterized by karyotyping and by labeling specific cytoskeletal markers. The expression of HIOMT by skin cells was evaluated by immunohistochemistry and by PCR, both with negative results, suggesting that skin in the bottlenose dolphin might not be able to synthesize melatonin.

La melatonina è un ormone ubiquitario, prodotto sia in vertebrati che in invertebrati, compresi batteri e protozoi, oltre che in piante superiori. Il suo ruolo principale nei vertebrati è quello di regolatore dei ritmi biologici, grazie a un pattern di secrezione che riflette l’alternanza del ciclo luce-buio durante il giorno, determinando ritmi circadiani. Nel corso dell’anno questo ritmo cambia continuamente in risposta alla variazione della lunghezza del giorno, determinando complessivamente un ritmo circannuale o stagionale. La melatonina circolante nei mammiferi è prodotta per la maggior parte dalla ghiandola pineale (o epifisi), struttura neuroendocrina posta sul tetto del terzo ventricolo e facente parte del diencefalo. Questa ghiandola nei cetacei è generalmente considerata assente, anche se i riscontri in letteratura sono contraddittori, dato che in alcune specie ne viene documentata la presenza. In altre specie ancora, alcuni autori la osservano in alcuni esemplari, mentre altri studi su individui conspecifici non la individuano. Quest’ultimo caso riguarda anche il comune tursiope (Tursiops truncatus), che è stato l’oggetto di questo studio. L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di valutare alcuni aspetti della produzione di melatonina, non ancora studiata in questa specie, da diversi punti di vista, macroscopico, fisiologico e biomolecolare. Per prima cosa è stata valutata la presenza della pineale in una serie di encefali di tursiope, dei quali nessuno sfortunatamente presentava la ghiandola. Per verificare se la melatonina fosse comunque prodotta in questa specie è stata organizzata la raccolta periodica di campioni di sangue da esemplari tenuti in cattività, nell’arco di sette mesi, in due gruppi in località distinte. La concentrazione di melatonina è stata determinata attraverso un radioimmunosaggio (RIA), che ha rivelato per la prima volta l’effettiva presenza dell’ormone nel sangue, con alcune fluttuazioni stagionali e variazioni giornaliere. La significatività di tali variazioni è stata purtroppo limitata dall’impossibilità di rispettare a pieno il disegno di campionamento, ottenendo meno campioni del previsto. Poiché la pineale è apparentemente assente ma il suo principale secreto è presente nel sangue di tursiope, è stata valutata la sua produzione da parte di siti alternativi. In letteratura è ampiamente documentata la produzione extrapineale di melatonina in alcuni tessuti, anche se il loro effettivo contributo ai livelli circolanti dell’ormone non è ancora del tutto chiaro. Nei mammiferi i tre principali siti extrapineali sono la retina, la ghiandola di Harder e l’intestino. È stata quindi indagata la potenziale secrezione di melatonina da parte di questi tessuti nel tursiope, tramite immunoistochimica contro l’enzima idrossiindol-O-metil-trasferasi (HIOMT), l’ultimo della via biosintetica dell’ormone. Come controllo positivo è stato utilizzata la pineale di bovino. Tutti e tre i tessuti sono risultati immunoreattivi, anche se con qualche differenza rispetto alla maggior parte dei mammiferi. Per verificare in modo alternativo la presenza dell’enzima nei tessuti immunopositivi, è stata valutata tramite PCR l’espressione del suo mRNA. Non essendo disponibili sequenze dell’enzima di alcun cetaceo sono state eseguite alcune prove con primer disegnati sulla sequenza di bovino (filogeneticamente vicino al tursiope), oltre che su quella ipotetica del gene di tursiope presente nella banca dati ENSEMBL, per un totale di cinque diverse coppie di primer. Nessuna di esse ha purtroppo dato esito positivo, nemmeno nei tre tessuti immunoreattivi, il che suggerisce la necessità di caratterizzare il gene di HIOMT in studi futuri per risalire alla corretta sequenza e disegnare primer specifici. Un ulteriore aspetto della produzione di melatonina nel tursiope, indagato in questo studio, è stato quello dell’utilizzo di un modello in vivo alternativo a quello dell’animale in toto, ovvero di colture cellulari. Poiché in letteratura è stata dimostrata la produzione di melatonina da parte della cute di alcuni mammiferi, ed essendo la pelle il tessuto più facilmente recuperabile durante la necroscopia di un cetaceo, sono state ricavate delle colture cellulari da campioni cutanei di tursiope. Le coltura primarie inizialmente ottenute sono state stabilizzate tramite processo di immortalizzazione, per poi caratterizzarle attraverso la determinazione del cariotipo e l’identificazione immunoistochimica di specifici marker citoscheletrici. L’espressione di HIOMT da parte delle cellule di cute è stata valutata sia attraverso immunocitochimica, sia attraverso PCR, entrambe risultate negative, suggerendo che la cute nel tursiope non sia un sito di produzione di melatonina.