Study of Rho GTPases in multiple myeloma: involvement of RhoU in disease initiation and progression

Multiple myeloma (MM) is a cancer of post-germinal center B cells characterized by a clonal proliferation of long-lived plasma cells inside the bone marrow. MM cells typically exhibit numerous structural and numerical chromosomal aberrations besides the presence of mutations in oncogenes and tumor-suppressor genes. Recently, a lot of attention has been drawn towards the tumor microenvironment. The interaction between malignant plasma cells and other cells inside the bone marrow is thought to be essential for the survival and expansion of MM. Indeed, stromal cells are able to produce growth factors that are important in sustaining the proliferation of MM cells, for example, interleukin-6 (IL-6). IL-6 triggers the signal downstream of its receptor IL-6R, leading to the activation of the JAK/STAT pathway. An important target of this pathway is STAT3 transcription factor. STAT3 binds to the promotor region of a set of genes that regulate cell growth, proliferation, survival, mitosis, adhesion/migration, and are extremely important in controlling the inflammatory response. RhoU is an atypical member of the Rho GTPase family that lies downstream of STAT3 activation. This GTPase is constitutively active whenever expressed and could mediate the effects of STAT3 in regulating the cytoskeleton dynamics. In MM nothing is known about this G protein. Here we demonstrate for the first time a role for RhoU in regulating the F-actin cytoskeleton of MM cells. RhoU was found heterogeneously expressed in MM patients’ cells, significantly modulated with disease progression, and expressed at higher levels in patients with bad prognosis mutations including t(4;14), del(13) and 1q gain. Different levels of RhoU mRNA correlate with a diverse gene expression profile in 557 genes. We have also found that it significantly clusters with cell cycle and DNA damage genes. Importantly, its expression positively correlates with cyclin D2 expression, and negatively correlates with the expression of cell cycle control and DNA damage response genes. In MM cell lines, RhoU is over-expressed in IL-6 dependent cell lines, while its expression is down-modulated in those that can proliferate independently of IL-6 stimulus. MM cell lines were able to up-regulate RhoU mRNA expression in response to IL-6 stimulus through the activation of STAT3. RhoU silencing led to an accumulation of actin stress fibers, an increase in adhesion and a blockade in migration. Lastly, immunomodulatory drugs (IMIDs) were recently found to control the activation of classical GTPases like Cdc42 and RhoA. In accordance with this, Lenalidomide positively regulated STAT3 activation leading to an increase in RhoU expression that resulted in a higher migration capability of MM cell lines, indicating that IMIDs can also alter the expression of atypical GTPases.

Il mieloma multiplo (MM) è un tumore caratterizzato dalla proliferazione di plasmacellule clonali all'interno del midollo osseo. Tipicamente, le cellule di MM presentano numerose aberrazioni cromosomiche strutturali e numeriche, oltre alla presenza di mutazioni in oncogeni e geni oncosoppressori. Recentemente molta attenzione è stata posta nei confronti del microambiente tumorale. L'interazione all'interno del midollo osseo tra le plasmacellule maligne e altre cellule è essenziale per la sopravvivenza e l'espansione del MM. Infatti, le cellule stromali sono in grado di produrre fattori di crescita importanti nel sostenere la proliferazione delle cellule di MM, per esempio, l'interleuchina-6 (IL-6). IL-6 attiva il segnale a valle del suo recettore IL-6R, determinando l'attivazione del pathway di JAK/STAT. Un importante bersaglio di questa cascata di segnale è il fattore di trascrizione STAT3. STAT3 si lega al promotore di una serie di geni che regolano la crescita cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza, la mitosi, l'adesione e la migrazione e che ricoprono un ruolo di estrema importanza nel controllo della risposta infiammatoria. RhoU è un membro atipico della famiglia delle Rho GTPasi che si trova a valle dell'attivazione di STAT3. Questa GTPasi è costitutivamente attiva quando espressa ed è sospettata di mediare gli effetti di STAT3 nella regolazione delle dinamiche del citoscheletro. Il ruolo di questa proteina nel MM è ignoto. In questo lavoro si dimostra per la prima volta un ruolo di RhoU nella regolazione del citoscheletro di actina delle cellule di MM. RhoU è stato riscontrato essere eterogeneamente espresso in cellule di pazienti di MM, significativamente modulato con la progressione della malattia ed espresso a livelli più alti in pazienti con aberrazioni t(4; 14), del(13) e 1q gain. Diversi livelli di RhoU correlano con un diverso profilo di espressione genica in 557 geni. È importante sottolineare anche che l'espressione di RhoU correla positivamente con l'espressione della ciclina D2 e negativamente con l'espressione di geni che controllano il ciclo cellulare e la risposta a danni al DNA. In linee cellulari di MM, RhoU è sovraespresso in quelle IL-6-dipendenti, mentre la sua espressione è down-modulata in quelle che possono proliferare indipendentemente da IL-6. Le linee cellulari di MM sono in grado di up-regolare l'espressione RhoU in risposta allo stimolo di IL-6, attraverso l'attivazione di STAT3. Il silenziamento di RhoU porta ad un accumulo di fibre di actina, un aumento della adesione e un blocco nella migrazione. Infine, è stato recentemente dimostrato come i farmaci immunomodulatori (IMiDs) controllino l'attivazione delle GTPasi classiche come Cdc42 e RhoA. In accordo con questo, abbiamo svelato che Lenalidomide regola positivamente l'attivazione di STAT3 portando ad un aumento dell'espressione di RhoU. Questo porta ad una capacità di migrazione più elevata nelle linee cellulari di MM, indicando che gli IMiD sono anche in grado di alterare l'espressione di GTPasi atipiche.