Optimized protocols for the analysis of mithocondrial respiratory chain enzymes in cells and tissues

Mitochondria are fundamental cellular organelles which decide about life and death of the cells. They are critically involved in a number of essential functions, including the production of energy through the respiratory chain enzymes, regulation of apoptosis, calcium metabolism and production of reactive oxygen species. Dysfunction of mitochondrial metabolism has been recognized a key player in a number of conditions, including mitochondrial disorders, diabetes, cancer, ageing, neurodegeneration and intoxications from drugs and poisons. Therefore, a reliable assessment of mitochondrial respiratory chain enzymatic activities is essential to investigate mitochondrial function in these disorders. However, previously published protocols were found to be inefficient due to sub-optimal tissue disruption, and results are inconsistent because of biochemical interferences leading to enzymatic inhibition, low specificity or low linearity of the kinetics, especially in the assays for complex I, III, IV. In response to these methodological issues, we systematically develop optimized protocols for a reliable assessment of the RC enzymatic function (complex I-IV, I+III, II+III) in bovine muscle homogenates using a single-wavelength spectrophotometer. Most of the analytical pitfalls rgarding complex I, III, IV could be overcome or at least limited. We analyzed, for the first time to our knowledge, the analytical performances of these assays, including the precision, specificity to the enzyme inhibitors, and linearity with time and protein concentrations. Next we validated these protocols to human muscle tissue and extend their applications to cultured cells, a variety of different species (mice, yeasts and C. elegans) and mouse tissues (i.e. liver, heart, brain). An efficient tissue disruption and the choice for each assay of specific buffers, substrates, adjuvants and detergents in a narrow concentration range, allow maximal sensitivity, specificity and linearity of the kinetics. These protocols allow for a reliable analysis of mitochondrial respiratory chain enzymatic activities with the single-wavelength spectrophotometer, and do not require isolation of mitochondria from tissues. These protocols are suitable for the biochemical diagnosis of mitochondrial disorders, as well as for research applications regarding mitochondrial dysfunction in health and disease. This work will be a useful reference for quality control surveys in laboratories specialized in the diagnosis of mitochondrial disorders.

I mitocondri sono organelli cellulari fondamentali con diverse funzioni critiche per la vita e la morte cellulare: la produzione di energia attraverso la catena respiratoria, la regolazione dell’apoptosi, il metabolismo del calcio, e la produzione di radicali dell’ossigeno. La disfunzione mitocondriale è un meccanismo patogenetico ricorrente alla base di una serie di condizioni, fisiologiche e patologiche, tra cui le malattie mitocondriali, il diabete, il cancro, varie malattie neurodegenerative, e vari fenomeni di tossicità da farmaci oppure veleni. Pertanto, l’utilizzo di metodi affidabili per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali è un fattore critico per studiare il ruolo dei mitocondri in tali patologie. Tuttavia, recenti osservazioni hanno evidenziato la presenza di diversi problemi analitici significativi derivanti dai protocolli precedentemente pubblicati in letteratura, tali da compromettere in alcuni casi la consistenza dei risultati. Tali problemi riguardano sia la fase pre-analitica, ovvero la fase di preparazione del campione biologico, che la parte analitica vera e propria spettrofotometrica, impattando negativamente la precisione dei saggi, la specificità e la linearità delle cinetiche. I problemi analitici più significativi riportati riguardano in particolare i saggi per il complesso I, III, e CIV, che sono anche gli enzimi più comunemente deficitari nelle malattie mitocondriali. Per sopperire a tali lacune, abbiamo sviluppato dei protocolli analitici ottimizzati per una analisi affidabile delle attività enzimatiche della catena respiratoria (complessi I-IV, I+III, II+III) attraverso un’analisi sistematica dei singoli steps analitici e pre-analitici. Per la fase di sviluppo dei protocolli abbiamo analizzato omogenati muscolari bovini con l’impiego di uno spettrofotometro a singola lunghezza d’onda. Sia l’impiego di un’efficace protocollo di lisi del campione che la scelta specifica di ciascun reagente (buffer, substrato, adiuvanti e detergenti) in un range ristretto di concentrazioni, sono risultati fattori in grado di influenzare enormemente la sensibilità, la specificità analitica e la linearità delle cinetiche. Sulla base dei risultati ottenuti abbiamo quindi selezionato i protocolli che risultassero in profili ottimali in termini analitici, permettendo di superare gran parte dei problemi analitici riportati in particolare a livello dei complessi I, III, IV. Abbiamo quindi effettuato, per la prima volta in letteratura, una analisi delle prestazioni analitiche di questi saggi biochimici, in termini di precisione, specificità rispetto all’aggiunta degli inibitori, e linearità delle cinetiche nel tempo attraverso la creazione di un indice di linearità, e la proporzionalità delle attività enzimatiche rispetto alla concentrazione di proteine. In una seconda fase abbiamo validato l’impiego di questi protocolli per campioni muscolari umani, e successivamente anche per colture cellulari, altre specie animali e organismi (topo, lievito, C. elegans), e vari tessuti murini (fegato, cuore, cervello). Questi protocolli permettono un’ analisi affidabile delle attività enzimatiche della catena respiratoria mitocondriale con l’uso di uno spettrofotometro a singola lunghezza d’onda, e non richiedono l’impiego di mitocondri isolati da tessuti. I protocolli implementati sono adatti per la diagnosi biochimica delle malattie mitocondriali, come per ricerche focalizzate sulla funzione mitocondriale in processi fisiologici o patologici. Questo lavoro fungerà da riferimento per futuri controlli di qualità e processi di standardizzazione nell’ambito della diagnostica specializzata in malattie mitocondriali.