Caratterizzazione molecolare delle comunità batteriche coinvolte nella maturazione del formaggio Montasio D.O.P.

This study provides a complete view of the composition of the microbial community in Montasio cheese obtained using a culture-independent approach. By molecular direct methods, microbial DNA and RNA were extracted from cheese matrixes without any culturing step. To identify the bacteria populations of raw milk and cheese samples, clone libraries were constructed from the 16S rRNA PCR amplified from DNA (and cDNA). T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) was used to identify clones and to investigate the community structure. real-time quantitative PCR (qRT-PCR) assays were also developed to detect and quantify three species and one genus of lactic-acid bacteria (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus spp.). One qRT-PCR assay was developed to detect Pseudomonas spp., a food spoilage related bacteria. Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. and Enterobacter spp., the most frequently reported psychrotrophs in raw milk, were found also in our milk samples. Streptococcus thermophilus, added as starter, was the predominant LAB species throughout the whole ripening period of Montasio cheese. Enterococci were also found and they resulted probably from milk. Instead, Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus casei were detected only in the mature cheeses. Expression analysis of TCS (two component regulatory system) genes were also performed by qRT-PCR. This work was a prelimanary study to evaluate the quality and quantity of RNA (extracted from cheese matrix) in gene expression studies.

In questo studio è stata analizzata la biodiversità microbica durante le fasi di produzione del formaggio Montasio D.O.P utilizzando un approccio coltura-indipendente. Con le metodiche molecolari è possibile estrarre il DNA e l'RNA microbico direttamente dalla matrice formaggio senza utilizzare alcuna metodica colturale di microbiologia classica. Per identificare le popolazioni batteriche del latte crudo e dei campioni di formaggio sono state costruite delle librerie 16S rRNA a partire da DNA e RNA. Il sequenziamento e il T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) sono stati impiegati per l'analisi dei cloni. Il T-RFLP è stato applicato anche per l'analisi diretta delle comunità microbiche presenti nei campioni di Montasio. Saggi in real-timePCR quantitativa (qRT-PCR) sono stati messi a punto per rilevare e quantificare tre specie e un genere di batteri lattici (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus spp.). Un saggio qRT-PCR è stato sviluppato per rilevare Pseudomonas spp. Acinetobacter spp., Pseudomonas spp. e Enterobacter spp., i batteri psicotrofi più comunemente riportati nel latte crudo, sono stati trovati anche nei campioni di latte analizzati in questo studio. Streptococcus thermophilus, aggiunto come starter, è stato la specie LAB (Lactic Acid Bacteria) predominante attraverso tutto il periodo di maturazione del formaggio Montasio. Anche enterococchi sono stati ritrovati durante le fasi di stagionatura e questi, probabilmente, derivavano dal latte crudo. Pediococcus pentosaceus e Lactobacillus casei sono stati rilevati solo nei campioni di formaggio stagionato. Sono stati messi inoltre a punto dei saggi in real-timePCR per studiare l’espressione di otto geni implicati nel sistema quorum-sensing in Streptococcus thermophilus. Questo è stato fatto per verificare l’applicabilità di studi di espressione genica su RNA batterico estratto direttamente dalla matrice formaggio con l'intenzione, in futuro, di utilizzare questa tipologia di studi per la caratterizzazione di funzioni geniche interessanti per la produzione di prodotti lattiero-caseari.