CARATTERIZZAZIONE GENETICA E FUNZIONALE DI FIBROBLASTI ISOLATI DA PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME DI ALSTROM

Alström Syndrome (ALMS) is a rare monogenic autosomal recessive disorder, characterized by a wide spectrum of clinical manifestations with multiple organ involvement and caused by mutations in the ALMS1 gene. Since 2006 our Hospital has offered the possibility to search for ALMS1 mutations under the full coverage of National Health Service. The role of genetic testing in ALMS individuals and families is still under debate. We evaluated the impact and usefulness of this service on population as well as the medical community, showing that the combination of typical signs and symptoms with the genetic investigation seems to reach a conclusive ALMS diagnosis in almost 80% of cases. Severe systemic fibrosis is a universal observation in postmortem and biopsy specimens of ALMS patients and may result in early organ failure and death. The molecular mechanisms involved in the development of ALMS fibrosis are poorly investigated and it is unknown if the fibrotic damage is a direct result of mutations in the ALMS1 gene or, alternatively, a secondary response to cellular insult due to the loss of ALMS1 function. We suggest that ALMS fibrosis could be a primary event and we focused on the role of ALMS1 mutations in the development of fibrosis using primary cultured fibroblasts of 4 ALMS patients obtained from derma, a region with no signs of fibrosis. Morphological analyses of two dimensional imaging of hematoxylin-eosin-stained fibroblasts evidenced that ALMS cells are more elongated, with well defined cytoplasmic extensions, compared to controls. ALMS fibroblasts cultured in hyaluronan-based scaffolds (3D cultures) to mimic the dynamic stress conditions stimulating formation of ECM showed cytoskeleton alterations and migration impairment. Microarray experiments detected 560 differentially expressed genes in ALMS fibroblasts, including genes related to ‘extracellular matrix (ECM) and fibrosis’, ‘cell cycle’, ‘apoptosis’ and ‘cellular architecture and motility’. Expression changes of these gene clusters correlated with enhanced collagen deposition, increased cell cycle length, and resistance to cell-death in ALMS fibroblasts. Taken together all our results give many insights about the ALMS fibroblast phenotype which can help us to understand the pathophysiology of ALMS, especially regarding the fibrosis. We suggest that fibroblasts carrying ALMS1 mutations divide more slowly and are less susceptible to apoptosis. Consequently, they continue to proliferate in an uncontrolled manner and produce an excess of ECM, resulting in fibrosis. ALMS fibroblasts are responsive to profibrotic inductors that could be present in the microenvironment and might contribute to the perpetuation of fibrosis. In conclusion, we show for the first time that fibrosis in ALMS is a primary defect due to ALMS1 mutations leading to the fibrotic phenotype described in ALMS patients. Secondly, ALMS fibrosis is a result of excessive ECM production and a failure to eliminate myofibroblasts by cell death. Our findings described ALMS1 as a multifunctional protein, with roles in cell cycle progression, migration, apoptosis and ECM production.

La Sindrome di Alström (ALMS) è una malattia genetica autosomica recessiva estremamente rara (circa 560 casi descritti nel mondo) causata da mutazioni del gene ALMS1, e caratterizzata da diversi quadri sintomatologici che coinvolgono molteplici sedi anatomiche. Nel nostro laboratorio è possibile effettuare un test genetico per la ricerca di mutazioni nel gene ALMS1, basato sul sequenziamento diretto del gene in soggetti che presentano un elevato sospetto clinico di ALMS. Dato il ruolo ancora dibattuto dell’analisi genetica in pazienti ALMS o in familiari, abbiamo cercato di valutare l’impatto e l’utilità di questo servizio, evidenziando come l’associazione di un’accurata anamnesi clinica e del test genetico reso disponibile consenta la formulazione di una diagnosi conclusiva in circa l’80% dei casi sospetti. In diversi reperti autoptici di tessuti di pazienti ALMS è stata descritta una estesa fibrosi interstiziale, che si ritiene poter essere responsabile delle progressive alterazioni funzionali che si osservano in modo particolare a livello cardiaco, epatico e renale, e che influenzano severamente la prognosi e la sopravvivenza dei pazienti. I meccanismi patogenetici alla base dello sviluppo della fibrosi in ALMS non sono ancora stati analizzati in dettaglio, e non è chiaro se rappresentino un effetto diretto della mutazione, o una risposta secondaria a un danno cellulare dovuto alla perdita di funzione del gene ALMS1. Il lavoro descritto in questa tesi analizza il ruolo di mutazioni del gene ALMS1 nello sviluppo della fibrosi utilizzando colture primarie di fibroblasti di 4 pazienti ALMS, ottenute da una biopsia cutanea in una zona che non mostrava segni di fibrosi. La caratterizzazione morfologica di colture bidimensionali ha evidenziato nei fibroblasti ALMS una forma allungata e la presenza di estroflessioni citoplasmatiche, che non si osservano nei fibroblasti di controllo. I fibroblasti ALMS, coltivati su supporti tridimensionali di acido ialuronico, che mimano condizioni dinamiche di stress fisiologico, stimolando la deposizione di matrice extracellulare (ECM), mostrano una ridotta motilità e una incapacità di migrazione all’interno della matrice di supporto stessa. Questo potrebbe indicare possibili alterazioni delle strutture citoscheletriche, come anche suggerito dalla particolare disposizione delle fibre del citoscheletro, parallela alla polarità del nucleo, evidenziata nei fibroblasti ALMS mediante microscopia elettronica. L’analisi del profilo d’espressione genica, mediante la tecnica dei microarrays, ha permesso di evidenziare nei fibroblasti ALMS la modulazione di numerosi geni che codificano per proteine che svolgono funzioni a livello della proliferazione, regolazione del ciclo cellulare e di fenomeni apoptotici. Sono inoltre risultati modulati geni per proteine della ECM, strutture implicate nella replicazione cellulare, microtubuli e filamenti intermedi. In accordo con i dati di array, abbiamo confermato mediante qPCR l’aumento dell’espressione nei fibroblasti ALMS di componenti della ECM (POSTN e collageni), che correla con una maggiore produzione di proteine collagene, quantificata attraverso l’analisi dell’incorporazione di 3[H]-prolina. I fibroblasti ALMS presentano inoltre un ciclo cellulare più lungo in diverse condizioni di coltura, una aumentata responsività a fattori pro-fibrotici e una maggiore resistenza alla morte cellulare indotta dal trattamento con diversi stimoli apoptotici. I risultati presentati in questa tesi descrivono alcuni aspetti del fenotipo dei fibroblasti ALMS che possono essere utili nella comprensione della fisiopatologia della Sindrome, con particolare riguardo alla fibrosi. Possiamo ipotizzare che la presenza di mutazioni a livello del gene ALMS1 determini nei fibroblasti un rallentamento del ciclo cellulare e una maggiore resistenza a stimoli apoptotici. Conseguentemente, i fibroblasti ALMS non vanno incontro a fenomeni di apoptosi, ma persistono, continuano a proliferare, seppur lentamente, producendo un eccesso di componenti della ECM, responsabile del progressivo rimodellamento della normale architettura tissutale, portando allo sviluppo di fibrosi. Il microambiente circostante potrebbe inoltre essere caratterizzato dalla presenza di numerosi mediatori pro-fibrotici e infiammatori, in grado di stimolare ulteriormente l’attività fibrogenica. Nel loro insieme, i risultati ottenuti permettono da una parte di considerare la fibrosi presente nella ALMS un difetto primario direttamente legato alla presenza di mutazioni del gene ALMS1, dall’altra suggeriscono che ALMS1 sia una proteina multifunzionale e intervenga in fenomeni intra- ed extra-cellulari.