Sviluppo di modelli sperimentali per valutare l'attività delle vescicole extracellulari derivate da cellule stromali mesenchimali come farmaci immunomodulatori: focus sul trattamento della malattia infiammatoria intestinale

Inflammatory Bowel Disease (IBD) is a group of multifactorial disorders characterised by chronic inflammation of the gut with alternating phases of recovery and relapse, including Crohn's Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC). Its incidence is increasing worldwide and different factors contribute to its development: deficiencies in epithelial integrity, immune response mechanisms and mucosal barrier function, whose complexity is difficult to reproduce in experimental conditions. The therapeutic strategies currently in use focus on modulating or suppressing the excessive immune response leading to mucosal inflammation, but they are still affected by limited efficacy and side effects. In the last few years, the European Medicines Agency (EMA) approved the use of mesenchymal stromal cells (MSCs) for the treatment of fistulas in Crohn’s disease. However, cell therapy is characterised by high production costs. It is well known that the main activity of MSCs is exerted by paracrine factors carried in extracellular vesicles (EVs). EVs are involved in different processes, such as immunomodulation, intestinal epithelial repair or immune homeostasis. In this scenario, we focused on the study of MSC-EVs, as therapeutic tool for the treatment of IBD, through the development and evaluation of several in-vitro, in-vivo and ex-vivo models. First, we developed in-vitro functional assays, testing the effects of MSC-EVs on the innate and adaptive immune system, using macrophage and lymphocyte cell lines respectively. We demonstrated the anti-inflammatory properties of MSC-EVs, both in preventing the acquisition of M1 pro-inflammatory phenotype in activated macrophages and by increasing the Th2/Th1 ratio in lymphocytes. We then investigated the effects of MSC-EVs in-vivo, in a well-established IBD murine model, i.e. colitis induced by sodium dextran sulphate administration, on the following parameters: i) clinical parameters; ii) M1/M2-like polarization of mucosal macrophages; iii) collagen deposition as an index of fibrosis. MSC-EVs restored the body weight loss and improved the disease activity index, reversed macrophages to an M2 anti-inflammatory phenotype and decreased collagen deposition in intestinal mucosa. Nevertheless, the above animal model does not fully reflect the complex pathophysiology of human IBD. Looking for an alternative experimental model closer to the clinical condition, we developed a 3D-IBD model, based on intestinal organoids starting from patient’s biopsies. To reproduce the IBD inflammatory state, we treated the organoids with a pro-inflammatory cytokines cocktail, and we added the MSC-EVs to evaluate their immunomodulatory activity. MSC-EVs treatment decreased some parameters of inflammation: they increased organoids size (compared to the pro-inflammatory condition) and decreased the percentage of inverted organoids (typical of the inflammatory state) and the gene expression of IL-8 and TNF-a. In conclusion, through the combination of these models, this PhD thesis provides significant advances in understanding the immunomodulatory activity of MSC-EVs and its possible application as therapeutic tool in IBD.

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono un gruppo di disturbi multifattoriali caratterizzati da infiammazione cronica dell'intestino con fasi alterne di recupero e riacutizzazione, tra cui la malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC). La sua incidenza è in aumento in tutto il mondo e diversi fattori contribuiscono al suo sviluppo: carenze nell'integrità epiteliale, nei meccanismi di risposta immunitaria e nella funzione di barriera della mucosa, la cui complessità è difficile da riprodurre in condizioni sperimentali. Le strategie terapeutiche attualmente in uso si concentrano sulla modulazione o sulla soppressione dell'eccessiva risposta immunitaria che porta all'infiammazione della mucosa, ma sono ancora caratterizzate da un'efficacia limitata e da effetti collaterali. Negli ultimi anni, l'Agenzia Europea dei Medicinali (EMA) ha approvato l'uso di cellule stromali mesenchimali (MSC) per il trattamento delle fistole nella malattia di Crohn. Tuttavia, la terapia cellulare è caratterizzata da costi di produzione elevati. È noto che l'attività principale delle MSC è esercitata da fattori paracrini trasportati in vescicole extracellulari (EVs). Le EVs sono coinvolte in diversi processi, come l'immunomodulazione, la riparazione dell'epitelio intestinale o l'omeostasi immunitaria. In questo scenario, ci siamo concentrati sullo studio delle MSC-EV come strumento terapeutico per il trattamento delle IBD, attraverso lo sviluppo e la valutazione di diversi modelli in-vitro, in-vivo ed ex-vivo. In primo luogo, abbiamo sviluppato saggi funzionali in vitro, testando gli effetti delle MSC-EV sul sistema immunitario innato e adattativo, utilizzando rispettivamente linee cellulari di macrofagi e linfociti. Abbiamo dimostrato le proprietà antinfiammatorie delle MSC-EV, sia nel prevenire l'acquisizione del fenotipo pro-infiammatorio M1 nei macrofagi attivati, sia nell'aumentare il rapporto Th2/Th1 nei linfociti. Abbiamo quindi studiato gli effetti delle MSC-EV in vivo, in un modello murino di IBD ben consolidato, cioè la colite indotta dalla somministrazione di destrano solfato di sodio, sui seguenti parametri: i) parametri clinici; ii) polarizzazione M1/M2-like dei macrofagi della mucosa; iii) deposizione di collagene come indice di fibrosi. Le MSC-EV hanno ripristinato la perdita di peso corporeo e migliorato l'indice di attività della malattia, hanno invertito i macrofagi verso un fenotipo antinfiammatorio M2 e hanno diminuito la deposizione di collagene nella mucosa intestinale. Tuttavia, il modello animale sopra descritto non riflette pienamente la complessa fisiopatologia delle IBD nell'uomo. Alla ricerca di un modello sperimentale alternativo più vicino alla condizione clinica, abbiamo sviluppato un modello 3D di IBD, basato su organoidi intestinali ottenuti da biopsie di pazienti. Per riprodurre lo stato infiammatorio dell'IBD, abbiamo trattato gli organoidi con un cocktail di citochine pro-infiammatorie e abbiamo aggiunto le MSC-EV per valutarne l'attività immunomodulante. Il trattamento con MSC-EV ha ridotto alcuni parametri dell'infiammazione: ha aumentato le dimensioni degli organoidi (rispetto alla condizione pro-infiammatoria) e ha diminuito la percentuale di organoidi invertiti (tipici dello stato infiammatorio) e l'espressione genica di IL-8 e TNF-a. In conclusione, grazie alla combinazione di questi modelli, questa tesi di dottorato fornisce progressi significativi nella comprensione dell'attività immunomodulatoria delle MSC-EV e della loro possibile applicazione come strumento terapeutico nelle IBD.