Use of Zebrafish models for studying Arrhythmogenic Cardiomyopathy

Arrhythmogenic Cardiomyopathy (AC) is a rare inherited cardiac disorder characterized by fibro-fatty replacement and progressive loss of the ventricular myocardium causing life-threatening arrhythmias, syncope and sudden cardiac death in young and athletes. Based on genotype-phenotype correlation, the spectrum of the AC phenotype was shown to be broader than previously believed. About 50% of AC cases carry one or more mutations in genes encoding for desmosomal proteins, including Desmoplakin (Dsp). However, also mutations in non-desmosomal genes have been identified in 1-3% of AC patients, such as Galcetin-3 (Gal-3), recently associated with the disease. I present here a stable Dsp knock-out (KO) zebrafish line able to model cardiac abnormalities and cell signalling dysregulation, characteristic of the AC disease, on which environmental factors and candidate drugs can be tested. In addition, I describe also a Gal-3 KO zebrafish line that reproduces the correlated cardiac phenotype and other observed dysregulations, for a better understanding of its role in AC pathogenesis. Our stable Dsp KO zebrafish line was characterized by structural abnormalities, pericardial effusion and/or hemopericardium, related with bradycardia and inflammatory response at larval stage. Histological analysis of mutated adult hearts showed reduced contractile structures and abnormal shape of the ventricle, with thinning of the myocardial layer, vessels dilation and adipose infiltration in the myocardium. Moreover, Transmission Electron Microscopy (TEM) analysis revealed “pale”, disorganized and delocalized desmosomes. Intensive physical training protocol caused a global worsening of the cardiac phenotype, accelerating the progression of the disease. Of note, we detected a dysregulation of the Wnt/β-catenin pathway, recently associated with AC pathogenesis. Pharmacological treatment of mutated larvae with SB216763, a Wnt/β-catenin agonist, rescued pathway expression and cardiac abnormalities, stabilizing the heart rhythm. The stable Gal-3 KO zebrafish line also presented a clear cardiac phenotype, like the Dsp mutant, showing the same types of structural changes associated with bradycardic phenotype, ventricular dilation and signalling pathway dysregulations. Cell death and inflammation were observed in the cardiac region of this mutant line, connecting it with these phases of the disease. Overall, our Dsp KO zebrafish line recapitulates many AC features observed in human patients, pointing at zebrafish as a suitable system for in vivo analysis of environmental modulators, such as the physical exercise, and the screening of pathway-targeted drugs. The Gal-3 KO zebrafish line confirms also in zebrafish the strict connection between mutations in this gene and cardiac alterations, attributable to AC. Moreover, cell death and inflammation, known to be involved in the remodelling of the myocardium, were observed and place this model at the centre of future more in-depth studies of the pathogenesis of the disease.

La cardiomiopatia aritmogena (AC) è una rara malattia cardiaca ereditaria caratterizzata da sostituzione fibro-adiposa e progressiva perdita del miocardio ventricolare, che causa aritmie potenzialmente letali, sincope e morte cardiaca improvvisa nei giovani e negli atleti. Sulla base della correlazione genotipo-fenotipo, lo spettro del fenotipo AC si è dimostrato più ampio di quanto si credesse in precedenza. Circa il 50% dei casi di AC presentano una o più mutazioni nei geni che codificano proteine desmosomiali, inclusa la Desmoplachina (Dsp). Tuttavia, nell'1-3% dei pazienti con AC sono state identificate anche mutazioni in geni non desmosomiali, come Galectina-3 (Gal-3), recentemente associata alla malattia. In questa tesi presento una linea zebrafish knock-out (KO) stabile mutata nel gene Dsp capace di riprodurre alterazioni morfo-funzionali cardiache e sregolazioni di vie di segnale, tipiche della malattia, su cui testare la possibile influenza di fattori ambientali e farmaci. Inoltre, descrivo anche una linea zebrafish KO per Gal-3 che presenta un particolare fenotipo cardiaco correlato ad AC e ad altre sregolazioni osservate, per cercare di comprendere meglio il suo ruolo nella patogenesi della malattia. La nostra linea di zebrafish Dsp KO ha presentato allo stadio larvale alterazioni cardiache, versamento pericardico e/o emopericardico, associati a un fenotipo bradicardico e una risposta infiammatoria. L'analisi istologica dei cuori adulti mutati ha mostrato strutture contrattili ridotte e forma anormale del ventricolo, con assottigliamento dello strato miocardico, dilatazione dei vasi e infiltrazione adiposa. Inoltre, l'analisi al microscopio ottico a trasmissione (TEM) ha rivelato desmosomi “pallidi”, disorganizzati e delocalizzati. Un allenamento fisico intensivo ha inoltre causato un peggioramento generale del fenotipo cardiaco, accelerando la progressione della malattia. Abbiamo infine rilevato una sregolazione della via Wnt/β-catenina, recentemente associata alla patogenesi dell'AC. Un trattamento farmacologico allo stadio larvale con SB216763, un agonista della via Wnt/β-catenina, ha mostrato un recupero dell’espressione della via e delle alterazioni cardiache, stabilizzando anche il ritmo cardiaco. Anche la linea stabile zebrafish KO per Gal-3 è stata contraddistinta da un chiaro fenotipo cardiaco, simile a quello della linea Dsp, mostrando gli stessi tipi di alterazioni associate ad un fenotipo bradicardico, alla dilatazione ventricolare e a sregolazioni delle vie di segnale. La morte cellulare e l'infiammazione sono state osservate nella regione cardiaca di questa linea mutante, collegandola chiaramente a queste fasi della malattia. Nel complesso, la nostra linea zebrafish Dsp-KO ricapitola molte caratteristiche AC osservate nei pazienti umani, indicando questo modello come un sistema adatto per l'analisi in vivo di fattori ambientali, come l'esercizio fisico, e lo screening di farmaci. La linea zebrafish Gal-3-KO conferma la stretta connessione tra le mutazioni trovate in questo gene e le alterazioni cardiache attribuibili a AC. Inoltre, sono state osservate morte cellulare e infiammazione, notoriamente coinvolte nel rimodellamento del miocardio, che pongono questo modello al centro di futuri studi più approfonditi sulla patogenesi della malattia.