Caratterizzazione della via BMP in cachessia tumorale

Cancer cachexia is a multi-factorial metabolic syndrome characterized by excessive body weight loss due to progressive fat and lean mass catabolism occurring in more than half of cancer patients. The loss of skeletal muscle mass and strength are considered as the most relevant features of cancer cachexia and predictors of poor outcomes. Bone Morphogenetic Protein (BMP)/Smad1/5/8 pathway is a positive regulator of muscle mass homeostasis. We demonstrated that diminished Smad1/5/8 signalling in muscles plays a critical role for the onset of cancer cachexia and that reactivation of the BMP pathway in the muscles of tumor-bearing mice prevents muscle wasting. The transcriptional activity of Smad1/5/8 is specifically required to mediate a beneficial effect on muscle mass. Moreover, several components of the BMP pathway are transcriptionally modulated in cachectic muscles. Using an unbiased genome-wide approach to investigate the chromatin remodeling that may occur in cancer cachexia, we performed ChIP-seq experiments in muscles to characterize histone modifications. We focused on H3K27Ac, a histone mark of active regulatory elements. An increase of acetylated histones was detected in muscles of C26-tumor bearing mice, compared to the control group. Process enrichment analysis reported the BMP pathway among the top 20 pathways with hyperacetylated histones. We searched for potential transcription factors binding sites in the hyperacetylated promoters of different BMP pathway components that are transcriptionally modulated in the context of cancer cachexia. To gather a comprehensive view on how the heterogeneity of muscle cells respond to cancer cachexia in skeletal muscle and on which are the cell types contributing to BMP dysregulation, we performed a single nucleus Multiome ATAC and Gene Expression experiment on tibialis anterior of control and C26 tumor-bearing mice. This approach provides simultaneous measurement within each individual nucleus of RNA expression (snRNA-seq) and chromatin accessibility (snATAC-seq). We investigated at the level of the single cell population the expression level of some BMP components, to evaluate how their expression change in response to cachexia. Beyond the single gene expression, we interrogated the sn multiomic data in an unbiased way and retrieve information about the most affected pathways in each cell population in the cachectic condition. Since multiomic approach can provide information on the open chromatin status of the different cell populations, in the future we will check for genes that are differentially upregulated in cachectic muscles and show an open chromatin in their promoter regions. The final aim is to study these regions to bioinformatically identify transcription factors binding sites to understand which putative signaling pathways are responsible for the transcriptional changes that lead to the cachectic phenotype in the different cell subpopulations in order to exploit new relevant molecular mechanisms with therapeutic potential. Our aim is to understand how cancer stimulates transcriptional changes leading to BMP-Smad1/5/8 inhibition in skeletal muscles to favor cachexia onset in order to identify new potential therapeutic targets.

La cachessia tumorale è una sindrome metabolica multifattoriale caratterizzata da un’eccessiva perdita di peso dovuta a un progressivo catabolismo di massa magra e massa grassa che rappresenta più della metà dei pazienti oncologici. La perdita di massa muscolare e di forza sono considerate tra i caratteri clinici più rilevanti in cachessia associata a cancro e un fattore prognostico negativo per il paziente. Il pathway Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Smad1/5/8 è un pathway regolatorio positivo per il mantenimento della massa muscolare. Abbiamo dimostrato che i ridotti livelli di SMAD1/5/8, un indicatore dell’attività via BMP, assumono un ruolo critico per l’insorgenza della cachessia tumorale e che la riattivazione della via BMP nel muscolo è sufficiente ad attenuare l’atrofia muscolare indotta dal tumore, dimostrando che un intervento BMP specifico nel muscolo può avere delle potenziali terapeutiche. Siccome la via BMP dipende dai fattori di trascrizione SMAD1/5/8 e da numerosi ligandi, recettori e inibitori il cui trascritto viene modulato nel muscolo, abbiamo ipotizzato che la presenza del tumore influisca sul trascrittoma del muscolo, portando ad un’inibizione della via BMP in risposta alla crescita tumorale e di conseguenza all’insorgenza del fenotipo cachettico. Abbiamo proceduto con un approccio unbiased e genome-wide per investigare il rimodellamento della cromatina che potrebbe avvenire in cachessia associata a cancro. Abbiamo eseguito un esperimento di ChIP-seq per H3K27Ac, un marker istonico di attività trascrizionale, nei muscoli di topi con tumore C26 e in topi sani. Nei muscoli di topi con tumore C26 è emerso un aumento di istoni acetilati (ovvero che rappresentano una cromatina aperta, trascrizionalmente attiva), rispetto al gruppo di controllo. L’analisi bioinformatica ha identificato le vie BMP e TGF-β tra le 20 vie con maggiore iperacetilazione istonica più rappresentative in cachessia. Abbiamo cercato potenziali siti di legami di fattori di trascrizione che sono trascrizionalmente modulati in condizioni di cachessia tumorale. Per avere una visione collettiva di come l’eterogeneità delle cellule muscolari rispondono alla cachessia associata a cancro nel muscolo e per capire quali sono i tipi cellulari che contribuiscono a inibire la via BMP, abbiamo condotto un esperimento di single nucleus Multiome ATAC and Gene Expression su tibiali anteriori di topi sani e topi con tumore C26. Questo approccio produce una misura simultanea all’interno del singolo nucleo dell’espressione dell’RNA (snRNA-seq) e dell’accessibilità della cromatina (snATAC-seq). Abbiamo esaminato per ogni singola popolazione cellulare il livello di espressione di alcune componenti della via BMP, per valutare come la loro espressione cambia in risposta alla cachessia. Al di là dell’espressione del singolo gene, abbiamo interrogato il nostro dataset di sn multiomic in maniera unbiased e abbiamo ottenuto informazioni circa le pathway che sono interessate in ogni popolazione cellulare in condizioni di cachessia tumorale. Dal momento che un approccio multiomico può fornire informazioni riguardo allo stato della cromatina aperta delle diverse popolazioni cellulari, nelle future analisi monitoreremo i geni che sono differenzialmente upregolati nei muscoli cachettici e presentano stati di cromatina aperta nelle regioni promotoriali. L’obiettivo finale di questa ricerca è quello di studiare queste specifiche regioni promotoriali aperte per identificare, attraverso metodi bioinformatici, i siti di legami di fattori di trascrizione per capire quali potenziali vie del segnale sono coinvolte nei cambiamenti trascrizionali che portano al fenotipo cachettico nelle diverse sottopopolazioni cellulari, con il fine di investigare nuovi rilevanti meccanismi molecolari con potenziale terapeutico.