Molecular profile characterization of pediatric Burkitt Lymphoma by RNA-Sequencing and Single Cell analysis

Burkitt Lymphoma (BL) is the most frequent childhood non-Hodgkin lymphoma (NHL) subtype, accounting for 40-50% of the cases. Chromosomal translocations affecting the MYC oncogene are the biological hallmark of BL and mostly involve the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus, or more rarely, one of the immunoglobulin light-chain (IgL) loci. Subsequent dysregulation of MYC expression has been shown to be driven by the respective immunoglobulin enhancer. Most mature B cell NHL (B-NHL) patients are currently cured, but the outcome for children with primary refractory or relapsed B-NHL is extremely poor, with fewer than 30% successfully salvaged despite the routine use of high-dose chemotherapy and stem cell transplant. The addition of rituximab to first-line therapy for children with high-risk B-NHL has resulted in ≥ 93% Event-Free Survival (EFS) in all risk groups. However, this success still relies on intensive multi-agent chemotherapy with significant acute toxicity and long-term sequelae. In this clinical scenario, the biological features, including genetic and epigenetic traits, underlying the different prognosis of BL patients are still largely unknown. Nonetheless, with few relapse events occurring, the identification of new prognostic biomarkers required to improve risk stratification in this rare patient group has become extremely challenging. Through different molecular approaches, we evaluated cell free DNA (cfDNA), extracellular vesicles with their miRNAs cargo and circulating tumor cells in liquid biopsy and promising results were obtained. Liquid biopsy allows molecular characterization of the tumor through a simple blood sample, a non-invasive method that can be easily repeated to monitor the tumor’s genetic changes over time. This procedure can help the clinicians with screening disease, stratification of patient risk, and monitoring of response to therapy. BL originate from germinal center (GC) B cells; we have dissected GC B cell heterogeneity by Single Cell transcriptomics, providing a framework to investigate the relationship between cell-of-origin, pathogenesis and outcome in GC-derived malignancies. It is known that BL is a highly proliferating tumor, but we found that not all cell clusters are in a proliferation status; some small subpopulations are in a so-called “activation condition”. In addition, not only tumor B cells were found in our samples, the large majority of our samples present T cells and macrophages infiltration. The activity of these infiltrating cells is being investigated to assess the immune system role to determine the response to chemotherapy. Finally, another interesting molecular marker that we evaluated was the mutational status of the tumor suppressor protein-p53; some mutational hot spots have highlighted a different EFS curve in comparison with wild type patients. The different biomarkers investigated will be the basis for a European collaboration for new therapeutic protocol design.

Il linfoma di Burkitt (BL) è il più frequente linfoma non-Hodgkin dell'infanzia (NHL) e rappresenta il 40-50% dei casi. Le traslocazioni cromosomiche coinvolgono l'oncogene MYC e il locus della catena pesante delle immunoglobuline (IgH) o, più raramente, uno dei loci della catena leggera delle immunoglobuline (IgL), e sono il segno distintivo di questo tumore. La maggior parte dei pazienti affetti da linfomi non-Hodgkin a cellule B mature (B-NHL) è guarito, questo non vale per circa il 30% dei bambini con B-NHL refrattario o recidivato perché nonostante la somministrazione di chemioterapia ad alte dosi e trapianto di cellule staminali la loro prognosi rimane infausta. L'aggiunta di rituximab alla terapia di prima linea per i bambini con B-NHL ad alto rischio ha portato al 93% di sopravvivenza senza eventi (EFS) in tutti i gruppi di rischio. Tuttavia, questo successo si basa ancora sulla chemioterapia intensiva multi-agente con significativa tossicità acuta e conseguenze a lungo termine. In questo scenario clinico, le caratteristiche biologiche, compresi i tratti genetici ed epigenetici, alla base della diversa prognosi dei pazienti BL sono ancora in gran parte sconosciute. Tuttavia, con pochi eventi di ricaduta, l'identificazione di nuovi biomarcatori prognostici necessari per migliorare la stratificazione del rischio, in questo raro gruppo di pazienti, è diventata estremamente difficile. Attraverso diversi approcci molecolari, abbiamo valutato il DNA libero circolante (cfDNA), le vescicole extracellulari con il loro carico di miRNAs e le cellule tumorali circolanti nella biopsia liquida; e sono stati ottenuti risultati promettenti. La biopsia liquida consente la caratterizzazione molecolare del tumore attraverso un semplice campione di sangue, un metodo non invasivo che può essere facilmente ripetuto per monitorare i cambiamenti genetici del tumore nel tempo. Questa procedura può aiutare i clinici con la diagnosi di malattia, con la stratificazione del paziente nel gruppo di rischio ed il monitoraggio della risposta alla terapia. Inoltre, abbiamo recentemente analizzato l'eterogeneità delle cellule B del centro germinativo (GC), da cui origina il BL, mediante l’analisi trascrittomica a singola cellula, in modo da avere un quadro per indagare la relazione tra la cellula di origine, la patogenesi e l'esito delle malignità derivate da GC. Il primo risultato interessante è lo stato di proliferazione delle cellule B. È noto che il BL è un tumore altamente proliferante, ma abbiamo scoperto che non tutti i cluster cellulari sono in uno stato di proliferazione; alcune piccole sottopopolazioni sono in una cosiddetta "condizione di attivazione". Inoltre, non solo i blasti tumorali B sono stati trovati nei nostri campioni, la stragrande maggioranza di questi presenta infiltrazione di cellule T e macrofagi. L'attività di queste cellule infiltranti è in fase di studio per valutare il ruolo del sistema immunitario nel determinare la risposta alla chemioterapia. Infine, un altro indicatore molecolare interessante che abbiamo valutato è lo stato mutazionale della proteina-p53 con ruolo di soppressore tumorale. Alcuni hot-spot mutazionali analizzati hanno evidenziato una diversa curva di sopravvivenza rispetto ai pazienti di tipo wild type. I diversi biomarcatori studiati costituiranno la base per una collaborazione europea per la progettazione di nuovi protocolli terapeutici più mirati.