The role of small extracellular vesicles in the modulation of premetastatic niche and tumor microenvironment in pediatric lymphomas

Non-Hodgkin lymphomas (NHL) are a series of malignant neoplasms originating from the lymphoid tissue and, in particular, tumor cells can derive from B or T cell progenitors. Small-extracellular vesicles (S-EVs) are lipid-bilayer enclosed vesicles that can be released by any cell type and found in all body fluids. S-EVs derived micro-RNAs (miRNAs) have generated great attention for their fundamental role in the regulation of gene expression and their aberrant expression in many tumors. Most of the studies about S-EVs miRNAs in lymphomas are focused on adults. Thus, so far, there is scarce information in the pediatric field. For these reasons the aim of this study was to characterize plasma S-EVs cargo in pediatric patients affected by NHL. Firstly, we demonstrated that miR-26a-5p is the most suitable reference gene for plasma S-EVs miRNA normalization in qPCR analysis, in the context of pediatric onco-hematological malignancies. Then, we profiled miRNAs cargo of plasma S-EVs in two different pediatric NHL subtypes, Anaplastic Large Cell Lymphoma (ALCL) and the leukemic stage of Burkitt Lymphoma also known as B-mature Cell Acute Lymphoblastic Leukemia (B-mALL). Differentially expressed miRNAs have been selected and validated, and their functional role in the biology of the tumor have been investigated. Small RNA sequencing data from plasma S-EVs showed a peculiar miRNA cargo in B-mALL compared to healthy donors (HD), revealing 40 small-RNAs significantly deregulated. We validated by qPCR the upregulation of miR-214-3p, miR-152-3p and miR-486-3p in patients’ S-EVs obtained at diagnosis; the significant decrease of these markers during chemotherapy suggests a tumor origin and corroborates their role as tumor biomarkers. Moreover, we demonstrated that leukemic cells and BM niche cells efficiently communicate between each other through S-EVs release and uptake, inducing modifications on target cells. We found an increased angiogenic potential of endothelial cells as a result of tumor-derived S-EVs treatment. Furthermore, mesenchymal stromal cells (MSCs) enhanced their migratory capacity after tumor-derived S-EVs treatment, approaching a cancer associated fibroblast phenotype. Recent evidence shows that leukemic cells can remodel BM niche also by blocking osteo-lineage development and inducing adipocyte formation. Interestingly, we confirm an increased adipogenesis and a decreased osteoblast formation in MSCs after tumor-derived S-EVs treatment. PTEN is an important regulator of MSCs differentiation; strikingly, miR-214-3p and miR-152-3p, upregulated in plasma S-EVs, negatively target PTEN. Interestingly, we found an increased activation of PTEN downstream pathways (enhanced phosphorylation of AKT and ERK) in MSCs overexpressing these two miRNAs. In summary, we demonstrated the potential role of S-EVs miRNAs cargo in modifying BM microenvironment, opening prospective for new targeted therapies in B-mALL. Small RNA sequencing of plasma S-EVs revealed a peculiar microRNA profile also in pediatric ALCL patients, when compared to HD. In particular, we validated the liver-specific miR-122-5p as more abundant in ALCL plasma S-EVs compared to HD, hyphotetizing a non- tumoral origin of this miRNA. We found that elevated levels of miR-122-5p correlate with advanced stage disease and impaired hepatic function in ALCL patients. In vitro experiments demonstrated that miR-122-5p inhibits glucose consumption in stromal cells, and the increased glucose availability enhances ALCL cell aggressiveness. Moreover, miR-122-5p promoted tumor dissemination in vivo. Overall, these data indicate that an increased level of miR-122-5p in circulating S-EVs of ALCL patients can promote cancer cells dissemination by inducing a metabolic change in the pre-metastatic niche. In conclusion, this finding sets the ground for investigating the clinical use of miR-122-5p antagonists in ALCL patients to potentially improve the clinical outcome.

I linfomi Non-Hodgkin (NHL) sono una serie di neoplasie che originano dal tessuto linfoide, in particolare da progenitori di cellule B o T. Le small-extracellular vesicles (S-EV), sono vescicole di piccole dimensioni racchiuse da un doppio strato fosfolipidico, potenzialmente rilasciate da qualsiasi tipo cellulare e ritrovate in ogni fluido corporeo. I microRNA (miRNAs) al loro interno, sono stati ampiamente studiati dato il loro ruolo fondamentale nella regolazione dell’espressione genica. Per quanto riguarda i linfomi però, molti di questi studi riguardano solo gli adulti; esistono quindi poche informazioni riguardo al loro ruolo nei linfomi pediatrici. Per questa ragione, lo scopo di questa ricerca è stato quello di caratterizzare il cargo delle S-EVs derivate dal plasma di pazienti pediatrici affetti da NHL. Innanzitutto, abbiamo dimostrato che il miR-26a-5p è il gene di riferimento migliore per la normalizzazione dei miRNAs nelle analisi di qPCR, nel contesto delle neoplasie onco-ematologiche pediatriche. Abbiamo poi caratterizzato, tramite small RNA-sequencing, il profilo dei miRNAs derivati dalle S-EVs del plasma di due diversi sottotipi di NHL pediatrici: il linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL), e lo stadio leucemico del linfoma di Burkitt, noto anche come leucemia linfoblastica acuta a cellule B mature (B-mALL). Per quanto riguarda le B-mALL abbiamo validato con qPCR la maggiore abbondanza dei miR-214-3p, miR-152-3p e miR-486-3p nelle S-EVs plasmatiche dei pazienti alla diagnosi. Il livello di questi miRNAs è significativamente più basso nelle S-EVs ottenute dal plasma di pazienti durante la chemioterapia. Questo risultato suggerisce che questi miRNAs siano validi biomarcatori tumorali della malattia. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule tumorali e quelle del midollo osseo comunicano efficientemente tra di loro tramite S-EVs. Infatti, le cellule endoteliali aumentano il loro potenziale angiogenico quando trattate con S-EVs di cellule leucemiche. Le cellule mesenchimali stromali (MSCs) aumentando le loro capacità di migrazione, aumentano anche il loro differenziamento adipocitico e inibiscono quello osteoblastico dopo trattamento con S-EVs tumorali. Interessante notare che PTEN, un importante regolatore del differenziamento delle MSCs, può essere negativamente regolato dai miR-214-3p e miR-152-3p, risultati più abbondanti nelle S-EVs plasmatiche dei pazienti. Analizzando le vie di segnale inibite da PTEN abbiamo infatti riscontrato una maggiore fosforilazione di AKT e ERK in MSCs over-esprimenti i due miRNA, dimostrando un loro ruolo nella regolazione di questi pathways. Riassumendo, in questa parte dello studio si è dimostrato il ruolo del cargo di miRNAs delle S-EVs nel modificare le cellule del microambiente del midollo osseo, aprendo nuove prospettive terapeutiche nelle B-mALL. Anche negli ALCL si è rilevato un profilo peculiare di miRNA delle S-EVs plasmatiche rispetto ai controlli sani. In particolare, in questi pazienti abbiamo validato la maggiore espressione del miR-122-5p, un miRNA specifico del fegato, ipotizzando una sua origine non tumorale. Esiste inoltre una correlazione di questo miRNA con gli stadi tumorali avanzati e con funzioni epatiche alterate. Esperimenti in vitro hanno poi dimostrato che il miR-122-5p inibisce il consumo di glucosio nelle cellule stromali, aumentando così la disponibilità di questo metabolita nella nicchia, favorendo infine l’aggressività delle cellule tumorali. Inoltre, il miR-122-5p può aumentare la disseminazione del tumore in vivo. Nel complesso, alti livelli di miR-122-5p nelle S-EVs circolanti in pazienti con ALCL possono promuovere la disseminazione tumorale inducendo cambiamenti metabolici nella nicchia premetastatica. In conclusione, questi risultati supportano l’ipotesi di un possibile uso terapeutico di antagonisti del miR-122-5p per migliorare l’esito clinico dei pazienti affetti da ALCL.