Caratterizzazione dei meccanismi molecolari associati alla patogenesi della Mucopolisaccaridosi di tipo I in un nuovo modello di Drosophila melanogaster

Mucopolysaccharidosis type I (MPSI) is an autosomal recessive disease, belonging to the group of the inborn errors of metabolism. It is due to mutations in the gene encoding for the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), leading to a deficit of the enzymatic activity. IDUA degrades the glycosaminoglycansheparan- and dermatan-sulfate, which accumulate undegraded in different tissues and organs, leading to a progressive multi-organ impairment. The syndrome presents a spectrum of phenotypes, from the attenuated forms, Scheie and Hurler-Scheie syndromes, to the severe form, Hurler syndrome. Clinical manifestations of the disease are facial dimorphisms, organomegaly, valvuolpathies, osteo-articular abnormalities, respiratory infections and, in the severe form, a progressive neurological impairment. Enzyme replacement therapy (ERT) and hematopoietic stem cells transplantation (HSCT) are available for the treatment. ERT, consisting in weekly infusions of the recombinant enzyme, although quite efficient in treating most peripheral tissues, is inefficient in treating both the CNS disease and some difficult districts, as bones and heart valves. Instead, HSCT is efficient in treating the CNS compartment slowing down the progression of the disease. However, it is effective if carried out very early in life and unable to revert clinical signs established before transplantation. Although clinically well characterized, the disease remains poorly understood from the pathogenic side, and the underlined molecular mechanisms are not enough clarified. Understanding the pathological mechanisms underlying MPSI could help to identify altered pathways involved in the pathogenesis, possibly addressable as new therapeutic targets. To this aim, in this project a Drosophila melanogaster model for MPSI was developed and characterized. Drosophila offers several advantages as an animal model, due to a short life cycle, which permits to perform rapid developmental studies conducted in a high number of flies, as well as rapid pharmacological screenings. In addition, it is easy to handle, and has relatively contained costs of maintenance. Furthermore, the availability of transgenic fluorescent lines allows to conduct simplified and accurate in vivo studies. The model was developed using the RNA interference approach. The ubiquitous downregulation of the Drosophila Idua homologue led to a decreased enzyme activity in the third instar larvae and to a complete lethality at pupal stage. The selective downregulation of D-idua in neurons and glial cells led to a mild, progressive locomotor impairment and, on the other hand, to an increased lifespan. The D-idua model showed some cellular and molecular features similar to those observed in other MPSI models, as an increased number and size of lysosomes, both in the brain and in the muscle tissue, together with a decreased percentage of acidified lysosomes. In addition, autophagy and metabolic pathways impairment were observed, both ameliorated in starvation conditions. Also, alterations of the mitochondrial network, together with impaired mitochondria oxidation status were recorded. Lastly, increased brain volumes and abnormal morphology of motor axon terminations represent signs of nervous system structural alterations. Overall, the MPSI Drosophila model appears to mimic some aspects of the human MPSI pathology, and shows strong alterations in some pathways, still poorly characterized in the disease. The model presents great potential for deepening the mechanisms involved in the pathogenesis of the disease. Starting from the involvement of different metabolic pathways, which in this project were shown to be drastically affected, the MPSI fly model offers the possibility to conduct in the future pharmacological screenings specifically targeted to these altered pathways.

La mucopolisaccaridosi di tipo I (MPS I) è una malattia autosomica recessiva, appartenente al gruppo delle malattie metaboliche pediatriche. È causata da mutazioni nel gene codificante per l’enzima lisosomiale a-L-iduronidasi (IDUA) che degrada i glicosaminoglicani (GAG) eparan- e dermatan-solfato. Di conseguenza,questi si accumulano non degradati in diversi tessuti e organi, causandone un progressivo malfunzionamento. MPS I presenta uno spettro di fenotipi, dalle forme attenuate, sindrome di Scheie e di Hurler-Scheie, a quella severa, la sindrome di Hurler. Le manifestazioni cliniche della malattia sono principalmente rappresentate da facies caratteristica, organomegalia, valvulopatie, alterazioni osteo-articolari, infezioni respiratorie, e, nelle forme severe, da un progressivo coinvolgimento neurologico. Sia la terapia enzimatica sostitutiva (ERT) che il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) sono oggi disponibili. ERT consiste nell’infusione settimanale dell’enzima ricombinante ed è parzialmente efficace nel trattare molti organi periferici, mentre è inefficace per il trattamento del sistema nervoso centrale (SNC) e per quello di alcuni distretti periferici, come ossa e valvole cardiache. Invece, l’HSCT è efficace nel trattamento del SNC, rallentando la progressione della malattia. Tuttavia, deve essere effettuato molto precocemente e non è in grado di revertere eventuali segni clinici instauratisi nelle fasi precedenti il trapianto. Sebbene clinicamente ben caratterizzata, la malattia rimane ancora poco conosciuta dal punto di vista patogenetico e i meccanismi molecolari coinvolti non sono ancora sufficientemente chiari. L’identificazione di pathway alterati coinvolti nella patogenesi, potrebbe potenzialmente fornire anche nuovi target terapeutici. A tale scopo, in questo progetto è stato sviluppato un modello basato su Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta. Drososphila offre diversi vantaggi come animale modello, dato il suo breve ciclo vitale, che permette di effettuare studi rapidi sullo sviluppo, condotti su un numero elevato di animali, così come rapidi screening farmacologici. Drosophila è semplice da maneggiare, con costi di mantenimento contenuti. La disponibilità di linee transgeniche fluorescenti permette di condurre semplici e accurati studi in vivo. Il modello è stato sviluppato utilizzando l’approccio dell’RNA interference (RNAi). La riduzione ubiquitaria dell’omologo del gene umano Idua in Drosophila (D-idua) porta ad una diminuita attività enzimatica nel terzo stadio larvale, e a una completa letalità allo stadio di pupa. La selettiva diminuzione di D-idua in neuroni e glia causa una lieve, ma progressiva, disfunzione motoria e, allo stesso tempo, un aumento dell’aspettativa di vita. Il modello di Drosophila mostra alcune caratteristiche simili a quelle osservate in vitro nei fibroblasti umani e nel topo, quali l’aumentato numero e dimensione dei lisosomi in cervello e tessuto muscolare, e una riduzione della percentuale di lisosomi acidificati. Sono state osservate disfunzioni autofagiche e alterazioni di alcuni pathway metabolici, entrambe migliorate in condizioni di deprivazione di nutrienti. Sono state anche osservate alterazioni della rete mitocondriale e un alterato stato ossidativo dei mitocondri. Infine, l’aumento del volume cerebrale e la morfologia alterata delle terminazioni degli assoni motori riflettono alcune alterazioni strutturali del sistema nervoso. Nel complesso il modello sembra mimare alcuni aspetti associati alla patologia umana, mostra forti alterazioni in alcuni pathways ancora poco caratterizzati e un grande potenziale per approfondire i meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia. A partire dalle alterazioni osservate, il modello di Drosophila offre la possibilità di svolgere futuri screening farmacologici indirizzati a questi pathways alterati.