Investigando il ruolo dell'autofagia nel sistema neuromuscolare.

Autophagy is an intracellular process, highly conserved among species and present in most cell types. This pathway is critical for ensuring quality control of cellular components and for the maintenance of cellular homeostasis, by removing damaged or unnecessary organelles, protein aggregates and long-lived proteins via lysosome-mediated degradation. During my PhD I carried out studies aimed at investigating autophagy in skeletal muscle and in myelinating glia of peripheral nervous system. Skeletal muscle is a highly plastic tissue in which the proper regulation of the autophagic flux is of crucial importance for the maintenance of basal homeostasis as well as under different catabolic conditions. Of note, autophagy in skeletal muscle is dysregulated in several myopathies, and its impairment is thought to be a major etiopathological mechanism of myopathies linked with mutations in Collagen VI (COL6) genes. For this reason, reactivating autophagy is one of the most promising therapeutic strategies for COL6-related myopathies. During my PhD I investigated this aspect by exploiting Col6a1–/– mice, the well characterized model for COL6-related diseases. In particular, I studied the effects of two nutraceuticals, which act as caloric restriction mimetic compounds. First, we published that in vivo oral administration for five days of the resveratrol analogue pterostilbene strongly promotes autophagic flux reactivation in Col6a1–/– mice, leading to the recovery of myofiber ultrastructural defects, with decreased apoptosis and muscle remodelling. Then, I tested four different conditions of spermidine (Spd) per os administration in Col6a1–/– mice, finding the regimen that, besides its ability to reactivate autophagy, also promotes the functional recovery of muscle strength. I showed that 30 mM Spd administration for 100 days in Col6a1–/– mice, besides improving muscle strength, leads to decreased apoptosis and lower incidence of centrally-nucleated myofibers, also rescuing the architecture of neuromuscular junctions. Besides the above studies, I carried out works aimed at increasing the knowledge of the physiological role of autophagy in muscle. Towards this aim, I characterized a new mouse model in which the key autophagic protein Ambra1 is genetically inactivated specifically in skeletal muscle. I found that lack of Ambra1 in myofibers leads to impaired mitophagic flux together with decreased recruitment of DRP1 and Parkin to mitochondria, causing a progressive accretion of dysfunctional mitochondria and lysosomes. In the second part of my PhD, I studied the impact of autophagy dysregulation in Schwann cells (SCs), which form the myelinating glia of the peripheral nervous system (PNS). Indeed, autophagy is known to be important both in SC differentiation during peripheral nerve development, regulating the proper occurrence of myelination, and in SC plasticity after nerve injury, contributing to myelin clearance and nerve repair. I generated and started to characterize a mouse line in which Beclin 1, a key protein in autophagy and membrane trafficking regulation, is specifically ablated in SCs. The so obtained Becn1SC/SC mice developed a severe recessive peripheral neuropathy, with massive involuntary tremors, progressive loss of the ability to walk properly, extensive demyelination, and severe muscle atrophy. At a cellular level, Beclin 1-deficient SCs, starting from few days after birth, display massive vesiculation, accumulate autophagic proteins, and are unable to properly myelinate axons. These results highlight the key role of Beclin1 in SCs for the proper development and function of the whole PNS, paving the way for the use of Becn1SC/SC mice as a valuable translational tool for research on peripheral neuropathies.

Durante il mio dottorato ho svolto una serie di studi mirati a studiare l’autofagia, processo che assicura la degradazione lisosomiale di vari componenti cellulari, nel muscolo scheletrico e nella glia mielinizzante del sistema nervoso periferico. Il muscolo scheletrico è un tessuto molto plastico, nel quale la fine regolazione del flusso autofagico è importante sia per mantenere l’omeostasi in condizioni basali, sia per garantire la risposta a differenti stimoli catabolici. Non stupisce quindi che l’autofagia sia alterata in diverse miopatie. In particolare, si ritiene che una difettiva capacità di indurre autofagia sia una delle cause alla base delle miopatie dovute a mutazioni nei geni che codificano il collagene VI (COL6). Ne consegue che una delle più promettenti strategie terapeutiche per queste miopatie consista nella riattivazione dell’autofagia. Durante il mio dottorato ho esplorato questo aspetto utilizzando il modello murino per le miopatie da collagene VI (Col6a1–/–). In particolare, ho studiato gli effetti della somministrazione di due nutraceutici che agiscono come composti in grado di mimare una restrizione calorica. In primo luogo, abbiamo pubblicato come nel topo Col6a1–/– la somministrazione orale per cinque giorni di pterostilbene, un analogo del resveratrolo, sia in grado di promuovere fortemente la riattivazione dell’autofagia, portando al recupero dei difetti ultrastrutturali delle miofibre, nonché alla diminuzione dei mionuclei apoptotici e al rimodellamento del muscolo stesso. In secondo luogo, ho testato quattro differenti condizioni di somministrazione orale di spermidina (Spd) nei topi Col6a1–/–,trovando quella che, oltre alla capacità di riattivare l’autofagia, è anche in grado di promuovere il recupero funzionale della forza muscolare. I risultati hanno inoltre mostrato che la somministrazione per 100 giorni di Spd 30 mM nei topi Col6a1–/– porta a diminuzione dell’incidenza di apoptosi e di fibre centronucleate, e al recupero della corretta morfologia delle giunzioni neuromuscolari. Inoltre, ho approfondito lo studio dell’autofagia nel muscolo caratterizzando un nuovo modello nel quale Ambra1, una proteina chiave nell’autofagia, è deleta specificatamente nel muscolo scheletrico. Ho così scoperto che la mancanza di Ambra1 nelle miofibre provoca difetti nel flusso mitofagico, con un minor reclutamento di DRP1 e Parkin al comparto mitocondriale, causando di conseguenza l’accumulo di mitocondri disfunzionali e di lisosomi. Nella seconda parte del dottorato mi sono dedicata allo studio dell’autofagia nelle cellule di Schwann (SC). L’autofagia in questo contesto è nota svolgere un ruolo sia nel differenziamento delle SC, regolando la mielinizzazione, sia nella plasticità delle SC a seguito di danno al nervo, contribuendo alla rimozione della mielina e alla riparazione nervosa. Ho generato e iniziato a caratterizzare una linea murina nella quale Beclin 1, proteina chiave nell’autofagia e nel trafficking di membrane, è specificatamente deleta nelle SC. Il topo così ottenuto sviluppa una marcata neuropatia periferica, con la comparsa di estesi tremori involontari, la progressiva perdita della capacità di camminare correttamente, estesa demielinizzazione e atrofia muscolare. A livello cellulare, la mancanza di Beclin 1 provoca, a partire da pochi giorni dopo la nascita, l’accumulo di vescicole nel citoplasma delle SC, con aumento di proteine autofagiche e incapacità di mielinizzare gli assoni. In conclusione, questi risultati sottolineano il ruolo chiave svolto da Beclin1 nelle SC per garantire il corretto sviluppo e funzionamento del sistema nervoso periferico.