RUOLO DELLA PROTEINA CHINASI CK1α NELLA MALATTIA OSSEA ASSOCIATA AL MIELOMA MULTIPLO

Multiple myeloma (MM) is a malignant plasma cell (PC) neoplasm which displays also pathological bone involvement. The bone marrow (BM) microenvironment sustains the MM associated bone disease (MMABD) characterized by impaired bone homeostasis. The Wnt/β-catenin pathway plays a critical role on mesenchymal stromal cell (MSC) differentiation towards the osteoblastic lineage, stimulating RUNX2, the master gene regulator of this process. Moreover, the effect of MM cells on osteoblastogenesis appears to be mediated by their capability to inhibit RUNX2 expression in MSC. The Ser/Thr protein kinase CK1α is overexpressed in MM cells supporting the tumor phenotype. Previous data demonstrated that CK1α inactivation causes MM cells apoptosis and cell cycle arrest, impinging on clonal expansion. Lenalidomide (Lena), an immunomodulatory drug (IMiD) used in MM therapy, is able to induce CK1α protein degradation in MM cells and although its effects on PCs has been intensively studied, its effects on the stromal compartment are still debated. CK1α has a negative role on Wnt pathway promoting β-catenin proteasomal degradation. Therefore, in this study we aimed at investigating whether CK1α inactivation could support the MSC osteogenic transcriptional program and positively promote osteogenesis in a context of MM BM niche. Moreover, the study pointed to unravel the effects of Lena on the MSC osteogenic differentiation potential, to better understand its possible impact on MMABD. We have demonstrated that CK1α inactivation in two different CSNK1A1 shRNA IPTG inducible MSC cellular clones, called respectively MSC hTERT 6044 and HS-5 6044, promoted the potential osteogenic differentiation of MSC towards the osteoblastic lineage, through the upregulation of the early osteogenic RUNX2 and the later ALP, SPP1 and BGLAP markers. To deeply investigate if CK1α could regulate osteogenesis also in the BM context, we reproduced the BM niche through a co-culture model between the MM IL-6 dependent INA-6 cells and a feeder layer of stromal cells represented by the MSC hTERT or HS-5 cells. We discovered that in this model of co-culture, a specific CK1α inactivation in MM cells or in the MSC hTERT could induce MM cells apoptosis and could support the osteogenic transcriptional program, with the potential to counteract the MMABD. However, using HS-5 as stromal feeder layer gave opposite results. Indeed, only when CK1α silencing was achieved both in MM and in HS-5 cells in the co-culture model, the osteogenic differentiation block induced by malignant PCs was overcome. Focusing our investigation on RUNX2 basal expression, we found that its expression in MM cells is mainly sustained by cell-to cell contact with stromal cells both with MSC hTERT and HS-5, rather than by soluble factors. Oppositely, RUNX2 expression in the stromal compartment represented by MSC hTERT and HS-5 cell lines depicted two different scenarios. Indeed, in the MSC hTERT cell line both soluble factors and cell-to cell contact caused a reduction of RUNX2 expression, which is instead unaffected in the HS-5 cell line. The different immortalization methods used in the two cell lines could be responsible for this discrepancy, since only MSC hTERT and not HS-5 cells could express the p53 protein. Next, we focused our study on Lena confirming that it is able to induce CK1α degradation also in MSC but it did not seem to have a positive role on the expression of osteoblastic related genes, thus likely limiting the osteogenic differentiation potential of MSC. Our results indicate that CK1α inactivation could be a promising therapy not only to enhance the pro-apoptotic effect of Lena on the haematological disease, but also to interfere with the undesirable effects of this drug on the osteogenic differentiation potential, likely ameliorating MMABD.

Il mieloma multiplo (MM) è una neoplasia ematologica caratterizzata dall’insorgenza di malattia ossea (MMABD). Il microambiente midollare è fondamentale sia per la sopravvivenza del clone plasmacellulare che per la progressione della MMABD. Diverse vie del segnale regolano il processo differenziativo delle cellule mesenchimali stromali (MSC) verso la linea osteoblastica, in particolare è fondamentale la via del segnale di Wnt/β-catenina. Tale via regola l’espressione di RUNX2, considerato il gene regolatore chiave dell’osteoblastogenesi. Inoltre, è noto come l’incremento di RUNX2 nelle plasmacellule (PCs) sostenga un fenotipo tumorale aggressivo ostacolando il differenziamento osteogenico delle MSC. È stato dimostrato come la Ser-Thr chinasi CK1α regoli diverse vie del segnale fondamentali per la sopravvivenza cellulare, controllando negativamente la via del segnale di Wnt/β-catenina. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato come la chinasi CK1α sia sovraespressa nelle Pcs e come la sua inattivazione ne aumenti l’apoptosi. Lenalidomide (Lena), farmaco immunomodulante usato in terapia, è noto degradare CK1α nel MM. Nonostante gli effetti di Lena sulle PCs siano noti, quelli sulla controparte mesenchimale sono ancora molto dibattuti. Lo studio si è proposto di indagare se l’inattivazione di CK1α potesse supportare un programma differenziativo in senso osteoblastico delle MSC, promuovendo l’osteogenesi in un contesto di microambiente midollare. Inoltre, il lavoro ha indagato gli effetti di Lena sul potenziale differenziativo osteogenico delle MSC, per comprendere come il trattamento farmacologico possa impattare sulla MMABD. Abbiamo dimostrato come l’inattivazione di CK1α in due differenti cloni di MSC IPTG inducibili chiamati MSC hTERT 6044 e HS-5 6044 promuovesse il differenziamento in senso osteogenico tramite l’incremento dell’espressione dei markers osteoblastici quali RUNX2, ALP, SPP1 e BGLAP. Tramite un modello di co-coltura tra cellule di MM IL-6 dipendenti INA-6 e cellule stromali MSC hTERT o HS-5, abbiamo indagato se CK1α potesse regolare l’osteogenesi anche in un contesto di microambiente midollare. Nel modello di co-coltura, la specifica inattivazione di CK1α in cellule di MM o in cellule MSC hTERT ha portato ad un’aumentata apoptosi delle PCs e supportato un programma differenziativo in senso osteoblastico delle MSC, potenzialmente contrastando la MMABD. Al contrario, l’utilizzo della linea HS-5 come controparte stromale ha portato a risultati opposti. Infatti, solo l’inattivazione di CK1α in entrambe le popolazioni cellulari della co-coltura è riuscita a superare il blocco differenziativo delle cellule MSC indotto dalle PCs. Studiando l’espressione basale di RUNX2 nelle cellule di MM è emerso come essa sia principalmente sostenuta dal contatto cellulare con la controparte stromale MSC hTERT o HS-5. Al contrario, nel comparto stromale sono emersi due distinti scenari: nelle cellule MSC hTERT sia i fattori solubili che il contatto cellula-cellula contrasterebbero l’espressione di RUNX2, non impedita invece nelle cellule HS-5. Il differente metodo di immortalizzazione usato nelle due linee cellulari stromali potrebbe essere responsabile di questa disparità di risultati, poiché solo le cellule MSC hTERT e non le HS-5 esprimono la proteina p53, a sua volta regolata da CK1α. Infine, abbiamo focalizzato lo studio su Lena, confermando come riduca l’espressione di CK1α anche nelle MSC pur non sostenendo l’espressione dei markers potenzialmente osteoblastici. I nostri risultati indicano come l’inattivazione di CK1α possa essere una promettente terapia non solo per la cura della malattia ematologica, aumentando l’effetto apoptotico di Lena sulle PCs, ma al contempo possa contrastare i possibili effetti indesiderati sul differenziamento osteogenico del comparto stromale, potenzialmente migliorando la MMABD.