IDENTIFICAZIONE DI UN NUOVO GENE DIPENDENTE DA TFEB ED ESERCIZIO FISICO

An increased lifespan as a sedentary mammal represents one of the strongest evolutionary challenges for humans, often resulting in whole-body metabolic maladaptation. Indeed, emerging chronic diseases, i.e., obesity, type 2 diabetes and cardiovascular complications are the major burdens of the new era that can however be prevented and cured re-establishing a “more active” lifestyle. The benefits of regular physical activity are long known even if the molecular networks that coordinate adaptive responses to exercise are still matter of debate. Recently, Transcription Factor EB (TFEB) has been shown to function as a master metabolic regulator in skeletal muscle, finely tuning fuel uptake to energy production during exercise; these findings strongly support TFEB activity as crucial for mediating the beneficial effects of exercise (Mansueto et al. 2017). Therefore, there is reason to think of the existence of TFEB and exercise dependent genes; in particular, we were interested in the identification of uncharacterized genes (RIKENs) (The RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team and the FANTOM Consortium, 2001) regulated both by exercise and TFEB activity. To do this, we crossed microarray data from TFEB overexpressing muscles (GSE62975) with muscular gene expression profiles of 4 weeks-trained mice (GSE54276). From this comparison, we identified a unique commonly upregulated RIKEN, hereafter referred as “Exe-RIKEN”. Starting from this finding, my PhD project has been focused on the molecular characterization of this new understudied gene. From bioinformatic analysis, we found that Exe-RIKEN gene maps in chromosome 19 and encodes a 1165 bp transcript; the mature mRNA is transcribed from two exons displaying a small putative ORF of 124 amino acids. Exe-RIKEN is strongly conserved in placental mammals, sharing more than 70% identity between human and murine nucleotidic and amino acidic sequences; moreover, the homolog gene is found in marsupials, but not in monotremes, suggesting a recent evolutionary origin. Overexpression experiments showed for the first time that Exe-RIKEN is a real protein coding gene both in vitro and in vivo. The presence of Exe-RIKEN transcript in skeletal muscle was validated via RT-qPCR; curiously, different hind limb muscles in sedentary mice show different Exe-RIKEN transcript levels, suggesting a possible Exe-RIKEN expression fiber type specificity. In vivo experiments on physiological and genetic exercise models allowed to confirm skeletal muscle Exe-RIKEN transcription up regulation in response to TFEB overexpression and during exercise recovery phase. Interestingly, ex vivo muscle stimulation showed that its transcription induction does not depend on extra muscular factors. RT-qPCR experiments with primers mapping on different Exe-RIKEN transcript regions suggest the presence of at least two transcript variants that differ on the 3’UTR length in skeletal muscle, highlighting a possible post transcriptional mRNA regulation. Immunofluorescence staining against the endogenous Exe-RIKEN showed that it differentially localizes in muscle fiber types, with a positive correlation between cross sectional area and immunostaining reactivity in glycolytic fibers; conversely, oxidative muscles such as soleus did not present cytoplasmic but a more nuclear Exe-RIKEN localization. In addition, overexpression and NES deletion experiments reveal that exercise is an Exe-RIKEN cytosol-to-nucleus shuttling stimulus in skeletal muscle. RNAseq on overexpressing Exe-RIKEN C2C12 shows an induction of genes belonging to the Gene Ontology terms relative to immunity and inflammation; intriguingly, similar results are obtained also after TFEB overexpression in cells (Irazoqui 2020). Altogether, these findings support Exe-RIKEN as a novel and compelling molecular player potentially mediating the adaptive inflammatory response to physical training in skeletal muscle.

Vivere come un mammifero sedentario, ma con una maggiore aspettativa di vita, rappresenta una delle sfide evolutive più impegnative per la nostra specie. Malattie croniche come l'obesità e il diabete di tipo 2 sono spesso conseguenza di tale condizione. Tuttavia, riadottare uno stile di vita “più attivo” può ripristinare una condizione di vita più sana. Sebbene i benefici dati da una regolare attività fisica siano noti da tempo, i meccanismi molecolari che li coordinano sono ancora oggetto di dibattito. Il fattore di trascrizione EB (TFEB) svolge un ruolo centrale nella regolazione del metabolismo del muscolo scheletrico coordinando l’assorbimento di nutrienti alla produzione di energia durante l’attività fisica. Tali risultati supportano l’attività di TFEB come un tassello fondamentale per la mediazione degli effetti benefici dell’esercizio fisico (Mansueto et al. 2017). Per queste ragioni, l’esistenza di geni dipendenti sia da TFEB che dall’esercizio fisico, è un’ipotesi più che plausibile, in particolare, tra questi, ci siamo focalizzati sull’eventuale presenza di geni non ancora caratterizzati dal punto di vista molecolare (RIKEN). Innanzitutto, abbiamo incrociato i dati provenienti da un microarray ottenuto da muscoli che over esprimono TFEB (GSE62975) con i profili di espressione genica muscolare di topi sottoposti ad un allenamento fisico (corsa) per 4 settimane (GSE54276). Da questo confronto abbiamo indentificato un'unica RIKEN up regolata in entrambe le condizioni e l’abbiamo denominata Exe-RIKEN. L’esplorazione di questo gene è cominciata sfruttando dei tool bioinformatici i quali mostrano che Exe-RIKEN mappa nel cromosoma 19 e codifica un trascritto di 1165 paia di basi; l'mRNA è trascritto da due esoni che putativamente contengono un piccolo ORF di 124 amminoacidi. La sequenza amminoacidica e nucleotidica di Exe-RIKEN ha un grado di omologia di circa il 70% tra uomo e topo. Il fatto che Exe-RIKEN possieda un gene omologo nei marsupiali, ma non nei monotremi, ne suggerisce una recente origine evolutiva. Sfruttando esperimenti di over espressione, abbiamo dimostrato per la prima volta che Exe-RIKEN è un gene codificante una proteina sia in vitro che in vivo. La presenza dell’mRNA di Exe-RIKEN nel muscolo scheletrico è stata confermata tramite RT-qPCR, suggerendo che l’espressione di Exe-RIKEN possa dipendere dal tipo di fibra. Esperimenti in vivo su modelli fisiologici e genetici di esercizio confermano che sia l’over espressione di TFEB, che la fase di recupero post esercizio, sono due condizioni in cui Exe-RIKEN è over espresso. Inoltre, la stimolazione muscolare ex vivo mostra che l’induzione della trascrizione di questo gene non dipende da fattori non muscolari. Esperimenti di RT-qPCR che sfruttano coppie di primer disegnate su diverse regioni dell'mRNA di Exe-RIKEN, indicano la presenza di almeno due varianti di trascrizione le cui differenze risiedono nella lunghezza del 3’UTR, suggerendo una possibile regolazione post-trascrizionale. Abbiamo inoltre mostrato una correlazione positiva tra area della sezione trasversale delle fibre glicolitiche e reattività dell'immunofluorescenza contro la proteina Exe-RIKEN endogena. Tuttavia, i muscoli ossidativi come il soleo presentano una localizzazione di Exe-RIKEN più nucleare. Inoltre, esperimenti di over espressione e di delezione del NES, rivelano che l'esercizio è uno stimolo in grado di indurre lo spostamento di Exe-RIKEN dal citosol al nucleo delle fibre muscolari. Esperimenti di RNAseq su cellule C2C12 che over esprimono Exe-RIKEN mostrano un’induzione di geni correlati ad immunità e infiammazione. Risultati analoghi sono stati ottenuti anche dopo l’over espressione di TFEB in cellule (Irazoqui 2020). Tali risultati enfatizzano Exe-RIKEN come un nuovo fattore molecolare che può potenzialmente mediare la risposta infiammatoria adattativa in risposta all’esercizio fisico.