Strategie biotecnologiche per la conversione di residui amidacei in poliidrossialcanoati

The environmental plastic pollution has a worldwide negative impact, enhancing the need for biodegradable and biocompatible substitutes. Bioplastics could be a very promising alternative and among all, polyhydroxyalkanoates (PHAs), accumulated inside the bacterial cells as energy storage have chemical-physical characteristics similar to the fossil-based plastics and are biodegradable and biocompatible. The main obstacle for their large-scale utilization is the costly carbon sources used, glucose and/or glycerol. Among the hundreds of bacterial species reported, Cupriavidus necator DSM 545 is a well-known PHAs-producers. In C. necator DSM 545, the accumulation of PHAs occurs under unbalanced environmental conditions such as the limitation of essential nutrients and the presence of a rich carbon source. To overcome the problem of the expensive growth substrates, in this study, low-cost agricultural waste were selected as carbon sources for C. necator DSM 545. Five by-products from rice (broken, unripe and discoloured rice) and sweet potatoes (white and purple sweet potatoes), were chosen for their starch content and availability and tested in a simultaneous saccharification and fermentation process. Unfortunately, as C. necator DSM 545 lacks amylolytic enzymes, an optimised dosage of a commercial enzymatic amylases blend, STARGENTM 002, was firstly added to the waste materials. The higher PHAs accumulation was obtained using broken rice and purple sweet potato with 44.09 and 34.42% of PHAs on cell dry matter at 96 h, respectively. Afterwards, the two promising substrates were evaluated for their direct conversion into PHAs through two strategies. In the first path, C. necator DSM 545 was, for the first time, efficiently engineered for the simultaneous expression of the Arthrobacter globiformis I42 G1d glucodextranase and the Zunongwangia profunda SM-A87 amyZ α-amylase genes. The recombinant C. necator DSM 545 #11 showed higher amylolytic activity on soluble potato starch and was adopted in a one-step PHAs production setting. The strain was able to directly convert broken rice and purple sweet potato into PHAs with 5.78 and 3.65 g/L of PHAs, respectively. In the second path, the hydrolysis and acidogenesis steps of the anaerobic digestion were exploited as alternative low-cost steps for hydrolysing and converting broken rice, selected as the most promising substrate, into volatile fatty acids (VFAs). C. necator DSM 545 is indeed able to use VFAs as carbon source for PHAs accumulation. Non-hydrolysed and enzymatically hydrolysed broken rice were exploited in two continuous stirred tank reactors at hydraulic retention times (HRTs) of 5, 4 and, 3 days. Effluents from non-hydrolysed broken rice reactor had VFAs profile higher than those monitored from hydrolysed broken rice reactor and were adopted for further experiments. The liquid fraction, rich in VFAs, was exploited as carbon source for the PHAs production by C. necator DSM 545, while the solid fraction was converted in methane (CH4) through biochemical methane potential (BMP) assays. The highest PHAs titers and CH4 yields, 0.95 g/L and 228.63 mL CH4/gVS, respectively, were achieved from effluents of 4 days HRT. Moreover, since both the acidogenesis reactors showed different intermediates profiles, the analysis of microbial community using Next Generation Sequencing approach (Illumina) was conducted to confirm the presence of different microorganisms established in the two reactors. Overall, in this PhD thesis, C. necator DSM 545 was efficiently exploited for the production of PHAs from a cluster of starchy substrates, and for the first time the strain was engineered to directly hydrolyse and accumulate PHAs from starchy carbon sources. Moreover, broken rice was also co-converted into two valuable products (PHAs and CH4) exploiting the acidogenesis step. Techno-economic analysis are ongoing to assess the viability of the developed biotechnological processes.

L’inquinamento ambientale derivato dalle materie plastiche ha portato ad impatti negativi evidenziando la necessità di ricercare possibili sostituti. Le bioplastiche potrebbero essere un’alternativa promettente e tra tutte, i poliidrossialcanoati (PHAs), con proprietà chimico-fisiche simili alle plastiche fossili, sono biodegradabili, biocompatibili e vengono accumulati all’interno delle cellule batteriche come riserva di energia. L’ostacolo principale al loro utilizzo in larga scala è rappresentato dalle costose fonti di carbonio adottate. Cupriavidus necator DSM 545 è il più noto produttore di PHAs ed accumula in condizioni ambientali sbilanciate come limitazioni di elementi essenziali e la presenza di una ricca fonte di carbonio. Quindi, in questa tesi di dottorato, per superare i problemi legati alle costose fonti di carbonio, gli scarti agro-industriali sono stati utilizzati come substrati per la crescita e la produzione di PHAs da parte di C. necator DSM 545. Sulla base del loro alto contenuto in amido e l’ampia disponibilità, cinque sottoprodotti dell’industria del riso (riso rotto e macchiato e grana verde) e di batata (varietà viola e bianca) sono stati testati in un processo di simultanea saccarificazione e fermentazione. Infatti, poiché C. necator DSM 545 non possiede enzimi amilolitici, in questa fase una miscela enzimatica commerciale amilolitica, STARGENTM 002, è stata aggiunta. Il più alto valore di PHAs è stato ottenuto da riso rotto e batata viola con 44.09 e 34.42% di PHAs sulla sostanza secca cellulare, rispettivamente. Questi due substrati promettenti sono stati quindi selezionati per la loro diretta conversione in PHAs attraverso due strategie. Nella prima strategia, C. necator DSM 545 è stato ingegnerizzato per la simultanea espressione di Arthrobacter globiformis I42 G1d glucodextranase e Zunongwangia profunda SM-A87 amyZ α-amilase. Il ceppo ricombinante C. necator DSM 545 #11 ha presentato la più alta attività amilolitica su amido solubile ed è stato adottato per la produzione one-step di PHAs. Il riso rotto e la batata viola sono stati convertiti direttamente in PHAs con rese, rispettivamente, di 5.78 e 3.65 g/L. Nella seconda strategia, le fasi di idrolisi e acidogenesi del processo di digestione anaerobica sono state utilizzate come alternative a basso costo per la conversione di riso rotto in acidi grassi volatili (VFAs). Infatti, C. necator DSM 545 è capace di accumulare PHAs anche in presenza di VFAs come sola fonte di carbonio. I substrati di riso rotto non idrolizzato ed enzimaticamente idrolizzato sono stati quindi convertiti in VFAs in un reattore a serbatoio continuo e con tempi di ritenzione idrica (HRTs) di 5, 4 e 3 giorni. Gli effluenti ottenuti dal reattore alimentato con riso rotto non idrolizzato hanno prodotto concentrazioni di VFAs più alte, e sono stati adottati per i successivi esperimenti. La frazione liquida degli effluenti, ricca in VFAs, è stata usata per la produzione di PHAs da parte di C. necator DSM 545, mentre la frazione solida è stata convertita in metano (CH4) tramite saggi del potenziale biochimico. Le più alte rese di PHAs e CH4, ottenute dagli effluenti prodotti durante 4 giorni di HRT, sono state di 0.95 g/L e 228.63 mL CH4/gVS. Inoltre, poiché il monitoraggio giornaliero di VFAs e alcoli prodotti dai due reattori ha evidenziato una loro diversa concentrazione, la comunità microbica è stata analizzata utilizzando il sequenziamento Illumina. Come risultato, in questa tesi, C. necator DSM 545 è stato efficientemente impiegato per la produzione di PHAs da scarti amidacei, e per la prima volta il ceppo è stato ingegnerizzato per l’espressione di enzimi amilolitici. Alternativamente è stata ottenuta una duplice conversione da riso rotto in prodotti ad alto valore economico (PHAs e CH4). Analisi tecnico-economiche sono in corso per analizzare l’effettiva riduzione di costo dei processi biotecnologici sviluppati.