Valutazione tecnologica e probiotica mediante approcci fisiologici e molecolari di nuovi batteri lattici isolati da alimenti fermentati tradizionali

Firstly, we have studied the microbial diversity and nutritional properties of “Yellow Curd” (Kashk zard) a traditional Persian fermented food, using classical microbiology approaches and 16S rRNA metabarcoding analysis. The metagenomics analysis revealed that lactic acid bacteria, particularly the genera Lactobacillus, Pediococcus and Streptococcus, were dominant in Yellow Curd. In addition, isolation, characterization and identification of new LAB with technological potential and probiotic properties, as well as functional foods preparation and characterization, have been carried out. The outcomes revealed that Pediococcus acidilactici strains IRZ12A and IRZ12B isolated from traditional Persian fermented food were safe and endowed with probiotic properties such as resistance to simulated gastrointestinal conditions and hypocholesterolemic effect. The complete genome of this promising P. acidilactici IRZ12B strain with the best cholesterol-lowering effect was sequenced, and the in-silico analysis evidenced the absence of plasmids, transmissible antibiotic resistance genes and virulence factors. Therefore, we tried to use P. acidilactici IRZ12B and three officinal plants, namely Malva, Calendula and Echinacea, for fermentation trials and consequently, possible functional food production. The fermented herbs with P. acidilactici IRZ12B were used to study their functionality on healthy and cancer cells. Results showed that fermented herbs with the probiotic strain did not have any cytotoxic effect on healthy human intestinal cells (differentiated Caco-2); however, they could significantly reduce cell viability on breast cancer cells (MCF-7). Secondly, some beneficial strains did not tolerate the storage condition and the human gastrointestinal passage. In this thesis, for the first time, we evaluated the use of 2′-fucosyllactose molecule in microencapsulation, and compared it with other known molecules, such as gelatin and inulin. Microcapsules, obtained by the extrusion technique, were evaluated in terms of encapsulation efficiency, storage stability, gastrointestinal condition resistance, and cell release kinetics. The alginate-based microcapsules showed interesting features, including the good capability to protect bacterial cells from harsh simulated gastrointestinal conditions. Compared to other molecules used in microencapsulation together with alginate, such as gelatin and inulin, 2’-fucosyllactose evidenced an extremely quick and abundant release of bacterial cells from the capsules inside a simulated intestinal fluid. Lastly, we have studied the technological properties of LAB isolated from a traditional fermented Indian food (Dahi). As a result, strain Limosilactobacillus fermentum ING8 was found to possess a safe status with very interesting technological properties, such as galactose utilization, antimicrobial activity, exopolysaccharide production and survivability to long-term storage at refrigeration temperature. The complete genome evaluation of this promising strain confirmed the absence of possible deleterious elements, such as acquired antibiotic resistance genes, virulence genes, or hemolytic-related genes. However, all structural genes related to galactose operon and EPS production have been detected.

In primo luogo, è stata studiata la diversità microbica e le proprietà nutrizionali della "Yellow Curd" (Kashk zard) un alimento fermentato tradizionale persiano, utilizzando approcci microbiologici classici e analisi del metabarcoding dell'rRNA 16S. L'analisi metagenomica ha rivelato che i batteri lattici, in particolare i generi Lactobacillus, Pediococcus e Streptococcus, erano dominanti in Yellow Curd. Inoltre, sono stati effettuati l'isolamento, la caratterizzazione e l'identificazione di nuovi LAB con potenziale tecnologico e proprietà probiotiche, nonché la preparazione e caratterizzazione di alimenti funzionali. I risultati hanno rivelato che i ceppi di Pediococcus acidilactici IRZ12A e IRZ12B isolati dal cibo fermentato tradizionale persiano erano sicuri e dotati di proprietà probiotiche come la resistenza a condizioni gastrointestinali simulate e l'effetto ipocolesterolemizzante. Il genoma completo di questo promettente ceppo di P. acidilactici IRZ12B con il miglior effetto ipocolesterolemizzante è stato sequenziato e l'analisi in silico ha evidenziato l'assenza di plasmidi, geni di resistenza agli antibiotici trasmissibili e fattori di virulenza. Pertanto, abbiamo cercato di utilizzare P. acidilactici IRZ12B con tre piante officinali, ovvero Malva, Calendula ed Echinacea, per prove di fermentazione e, al fine di verificare la possibile produzione di alimenti funzionali. Le piante fermentate con P. acidilactici IRZ12B sono state utilizzate per studiarne la funzionalità su cellule sane e cancerose. I risultati hanno mostrato che le erbe fermentate con il ceppo probiotico non hanno avuto alcun effetto citotossico sulle cellule intestinali umane sane (Caco-2 differenziato) e potrebbero invece ridurre significativamente la vitalità cellulare sulle cellule del cancro al seno (MCF-7). Successivamente, dato che alcuni ceppi probiotici non hanno tollerato la condizione di conservazione e il passaggio gastrointestinale umano, in questa tesi, per la prima volta, abbiamo valutato l'uso della molecola di 2′-fucosillattosio in microincapsulazione e l'abbiamo confrontata con altre molecole note, come la gelatina e l'inulina. Le microcapsule, ottenute con la tecnica dell'estrusione, sono state valutate in termini di efficienza di incapsulamento, stabilità di conservazione, resistenza alle condizioni gastrointestinali e cinetica di rilascio cellulare. Le microcapsule a base di alginato hanno mostrato caratteristiche interessanti, inclusa la buona capacità di proteggere le cellule batteriche dalle difficili condizioni gastrointestinali simulate. Rispetto ad altre molecole utilizzate in microincapsulazione insieme all'alginato, come la gelatina e l'inulina, il 2'-fucosillattosio ha evidenziato un rilascio estremamente rapido e abbondante di cellule batteriche dalle capsule all'interno di un fluido intestinale simulato. Infine, sono state studiate le proprietà tecnologiche di un LAB isolato da un tradizionale alimento indiano fermentato (Dahi). Si è rilevato che il ceppo Limosilactobacillus fermentum ING8 possiede proprietà tecnologiche molto interessanti, come la capacitò di utilizzo del galattosio, l'attività antimicrobica, la produzione di esopolisaccaridi e la capacità di sopravvivenza alla conservazione a lungo termine a temperatura di refrigerazione. La valutazione completa del genoma di questo promettente ceppo ha confermato l'assenza di possibili elementi deleteri, come geni acquisiti di resistenza agli antibiotici, geni di virulenza o geni correlati all'emolisi, mentre sono stati rilevati tutti i geni strutturali correlati all'operone galattosio e alla produzione di EPS.