LE CARATTERISTICHE MOLECOLARI DEL CARCINOMA PAPILLARE DELLA TIROIDE NON IODOFISSANTI

ABSTRACT Background: Differentiated thyroid cancers (DTC) represent the most frequent endocrine cancer. They typically show an indolent behaviour and a good prognosis, mainly due to their capability to trap radioiodine (131-I), the most powerful therapeutic tool in these malignancies. Nevertheless, approximately one third of thyroid cancer metastases do not concentrate radioiodine. The most common genetic event in papillary thyroid carcinoma is a transversion in exon 15 of the BRAF gene which leads to a V600E aminoacid substitution (glutamic acid instead of valine) ranging from 36% to 48%. It has been demonstrated that cancers with the BRAF mutation have a more aggressive behaviour: the mutation is associated with more advanced initial tumor stage at diagnosis and with conversion into less differentiated or anaplastic cancers during the follow-up. BRAF could represent a new independent prognostic factor helpful to identify cancers that both tend to recur more frequently and lose the capability to trap radioiodine. The BRAF mutation is also associated with an increased expression of the glucose transporter (GLUT-1), suggesting the possibility to use 18-FDG-PET-CT examination during the follow-up. The objective of the study: 1) to estimate the frequency of the BRAF mutation in primary papillary cancers, in lymphonodal metastases at diagnosis and in recurrences; to value whether the BRAF mutation frequency is higher in relapsing cancers, particularly in those with no radioiodine uptake; 2) to determine whether the BRAF mutation is associated with increased glucose metabolism phenotypes. Patients and methods: 42 consecutive recurrences, belonging to 42 PTC affected patients who underwent surgery, were analysed. At the time of diagnosis they were subjected to thyroidectomy and to 131-I radioablation; then they were submitted to a total body scintigraphic examination 3 days after a 131-I therapeutic dose (2,7- 5,4GBq). 23/42 patients were submitted to a FDG-PET-CT examination as well. All the samples were paraffin embedded: DNA extraction was performed according to the manufacturer’s recommendations. Genomic DNA was evaluated for the existence of mutations of the BRAF gene by PCR amplification of the target DNA sequences followed by both direct sequencing and MASA. Results: recurrences were analysed under the TNM classification: 10/42 (24%) were T1, 8/42 (19%) were T2, 4/42 (10%) were T3 and 18/42 (43%) were T4. (TNM classification was not available for 2/42 patients). The average age at diagnosis was 40, the median was 35-yr-old (min 16, max 79), the average age at the time of recurrence was 45, the median was 43-yr-old (min 16, max 82). The average serum Tg concentration during suppressive therapy with l-T4 was 181, the median was 7 ng/ml (min <0,5- max 3344). 11/42 patients had anti-Tg autoantibodies. 19/37 (51%) recurrences with no 131-I uptake showed the BRAF mutation, while 1/5 (20%) recurrence with 131-I uptake showed the mutation. In 15 recurrences (14 with no 131-I uptake and 1 with 131-I uptake) we correlated the presence of the BRAF mutation with both the capability to trap 131-I and 18-FDG: among the recurrences with no 131-I uptake 73% could concentrate 18-FDG and 20% could not, the one that trapped 131-I trapped also 18-FDG. The recurrences with BRAF mutation showed also an increased SUV. In 10 patients a simultaneous analysis of BRAF status was conducted in primary cancers (K0), in lymphonodal metastases at diagnosis (N0) and in surgically removed first (R1) and second recurrences (R2): the BRAF mutation was detected in 2/10 (20%) primary cancers, in 3/7 (42%) lymphonodal metastases at diagnosis, in 7/10 (70%) recurrences with no 131-I uptake and in 2/2 (100%) second recurrences. By DNA sequencing we discovered a new BRAF mutation in exon 15 codon 602, which determine an aminoacidic substitution (phenylalanine instead of serine, S602F). Conclusions: 1) BRAF mutations are more frequent in recurrences with no 131-I uptake than in those with 131-I uptake (51% versus 20%); 2) de novo BRAF mutations were shown in thyroidal recurrences during the follow-up (20% versus 42% and 70% respectively in primary cancers, in lymphonodal metastases and in recurrences); 3) the presence of BRAF mutations has an inverse correlation with the capability to trap 131-I, and a direct one with the ability to concentrate 18-FDG and it is related to a higher level of 18-FDG uptake; 4) a new mutation occurs in exon 15, codon 602 of the BRAF gene and it causes the substitution of a polar aminoacid (serine) with a non polar one (phenylalanine). Our study confirms that BRAF is a possible molecular indicator of poor prognosis because its mutation is associated with more aggressive, less differentiated and unable to trap radioiodine recurrences.

Presupposti dello studio: i carcinomi papillari tiroidei (PTCs) costituiscono la neoplasia endocrina più frequente e si caratterizzano per un decorso indolente e una bassa mortalità, dovuta principalmente alla capacità di questi tumori di concentrare lo iodio e alla possibilità di essere efficacemente trattati con iodio radioattivo (131-I). Tuttavia in circa un terzo dei pazienti, in particolare in corso di malattia persistente o ricorrente, viene persa la capacità di captare lo 131-I. Una mutazione somatica interessante l’esone 15 della serina-treonina-chinasi BRAF, realizzante la sostituzione di una valina con glutammato (V600E), rappresenta l’evento genico più frequente alla base dello sviluppo del carcinoma papillare tiroideo, documentabile nel 36-48% dei casi. Diversi studi hanno messo in evidenza che i carcinomi papillari con mutazione di BRAF hanno un atteggiamento più aggressivo, presentandosi in stadio più avanzato alla diagnosi e potendo evolvere verso istotipi meno differenziati o anaplastici nel follow-up. BRAF potrebbe pertanto rappresentare un nuovo fattore prognostico indipendente, in grado di identificare i carcinomi papillari a maggior rischio di recidiva e di perdita della capacità di concentrare lo 131-I. La mutazione di BRAF è inoltre associata ad un’aumentata espressione del trasportatore del glucosio GLUT1, suggerendo l’utilità di tecniche di imaging, quali la 18-FDG-PET-TC, nel follow-up dei pazienti con recidiva di tumore tiroideo differenziato. Scopo dello studio: 1) valutare la frequenza di mutazioni BRAF nei carcinomi papillari primitivi, nelle metastasi linfonodali al momento della diagnosi e nelle recidive e definire se tale frequenza sia maggiore nei tumori che recidivano e in particolare in quelli con recidive non iodofissanti; 2) valutare se la presenza di mutazioni BRAF si correli ai fenotipi con accelerato metabolismo del glucosio FDG-PET positivi. Pazienti e metodi: abbiamo selezionato 42 pazienti consecutivi operati per recidiva di carcinoma tiroideo differenziato; alla diagnosi tutti i pazienti erano stati sottoposti a tiroidectomia totale e a terapia radioablativa con 131-I. In questi pazienti la scintigrafia totale corporea è stata eseguita 3 giorni dopo una dose terapeutica di 131-I (2,7-5,4 GBq) dopo aver sospeso la terapia con ormone tiroideo. 23/42 pazienti sono stati sottoposti a 18FDG PET-TC. La presenza di mutazioni a carico dell’esone 15 di BRAF è stata analizzata tramite sequenziaggio e PCR allele-specifica (MASA). Risultati: tra le recidive di carcinoma papillare, in base allo staging tumorale, 10/42 (24%) erano T1, 8/42 (19%) T2, 4/42 (10%) T3 e 18/42 (43%) T4. (Di 2/42 pazienti non era disponibile la classificazione TNM). L'età media alla diagnosi era di 40, la mediana 35 anni (min 16, max 79). L'età media al momento della recidiva era di 45, la mediana 43 anni (min 16, max 82). La media dei valori di Tg durante terapia soppressiva era 181, mentre la mediana era 7 ng/ml (min.<0.5 max 3344). 11/42 pazienti presentavano positività/persistenza degli anticorpi anti-Tg durante il follow-up. BRAF risultava mutato in 19/37 (51%) recidive non iodofissanti e in 1/5 (20%) delle iodofissanti. Abbiamo quindi correlato la presenza di mutazioni BRAF con la capacità di captare il radioiodio e il 18-FDG (15 casi): di tali 15 casi, 14 erano recidive non iodiofissanti, mentre 1 era iodofissante. Nell’insieme delle recidive BRAF-mutate, tra le non iodofissanti 73% captavano il 18-FDG e 20% non lo captavano, mentre l’unica recidiva iodofissante BRAF-mutata era PET-positiva. Inoltre la presenza della mutazione correlava con gli indici di uptake più elevati. In 10 pazienti l’analisi delle mutazioni di BRAF è stata condotta simultaneamente sul tumore primitivo (K0), sulla metastasi linfonodale al momento della diagnosi (N0) e sulla prima recidiva non iodofissante (R1) asportata chirurgicamente e sulle eventuali successive (R2): BRAF risultava mutato in 2/10 (20%) tumori primitivi, in 3/7 (42%) metastasi linfonodali al momento della diagnosi e in 7/10 (70%) prime recidive non iodofissanti e 2/2 (100%) seconde recidive. Tramite sequenziaggio abbiamo inoltre dimostrato una nuova mutazione che interessa il codone 602 dell’esone 15 di BRAF e porta alla sostituzione dell’amminoacido serina con la fenilalanina (S602F). Conclusioni: nel nostro studio abbiamo dimostrato che 1) le mutazioni BRAF sono più frequenti nelle recidive non iodofissanti rispetto a quelle iodofissanti (51 % versus 20 %); 2) esse possono comparire de novo in corso di recidiva di tumore tiroideo primitivo (20% versus 42% e 70% rispettivamente nel tumore primitivo, nella metastasi linfonodale alla diagnosi e nella recidiva non iodofissante); 3) esiste una correlazione inversa tra la presenza della mutazione e la capacità di fissare lo iodio, ed un’associazione diretta tra la presenza della mutazione e la capacità di captare il 18-FDG e le recidive che mostrano la mutazione V600E hanno un indice di captazione elevato, suggerendo quindi l’esistenza di una correlazione tra il grado di captazione di 18-FDG e la presenza della mutazione; 4) una nuova mutazione di BRAF non riportata in Letteratura è presente a livello del codone 602 dell’esone 15 di BRAF e determina la sostituzione di un amminoacido polare - serina - con uno apolare - fenilalanina. In base ai dati del nostro studio sembrerebbe che BRAF si confermi come probabile marcatore molecolare di prognosi povera, in grado di promuovere lo sviluppo di recidive più aggressive, meno differenziate e meno iodocaptanti durante il follow-up.