Attività pro-angiogenica di urotensina-II su cellule endoteliali vascolari umane

Urotensin-II (U-II) is a cyclic peptide, originally isolated from the urophysis of the goby Gillichthys mirabilis. The human form of U-II (hU-II) is a cyclic undecapeptide. Mature hU-II is synthesized from a large precursor molecule, the prepro-U-II, whose mRNA has been found in many tissues. U-II has been identified as the endogenous ligand of a specific high-affinity receptor, recently identified as the orphan receptor GPR14 which has been renamed urotensin receptor (UT). The human UT isoform belongs to the class A superfamily of G-protein-coupled receptors. The principal physiological role of U-II in mammals is in the cardiovascular system, where it exerts a potent systemic vasoconstrictor and hypertensive effect and several lines of evidence suggested that U-II might be involved in the pathophysiology of the cardiovascular system. On endothelial cells (EC) of animal origin U-II has also been shown to exert a clearcut pro-angiogenic effect, but few experimental data are presently available clarifying the effect of U-II in human endothelium. Thus, in the present study in vitro models based on human vascular endothelial cells directly isolated from different normal human vessels, including saphenous vein (HSVEC), jugular vein (HJVEC), umbilical vein (HUVEC) and aorta (HAEC) have been used to characterize different aspects of the pro-angiogenic profile exhibited by U-II. RT-PCR and ICC analyses indicated that UT was expressed by all the human EC considered, while the expression of U-II resulted heterogeneous, in fact the peptide was detectable in HAEC and HUVEC only. When tested in the Matrigel assay all the investigated EC exhibited a strong angiogenic response to the peptide, with the formation of a meshwork of capillary-like structures of increased density and complexity when compared to the unstimulated condition. The effect was comparable to that of FGF-2 and was counteracted by Palosuran, a specific antagonist of UT, indicating that they were triggered by the binding of U-II to its receptor. Interestingly, in EC derived from adult vessels this activity was not associated with a proliferogenic effect. On the contrary, U-II induced a moderate but significant increase of cell proliferation in HUVEC. Experiments performed in the presence of specific inhibitors of various steps of the signaling cascade showed that the U-II induced self organization of the cells in capillary-like structures is PKC dependent and involves the activation of the ERK1/2 transduction pathway. Western blot analyses on the phosphorilated forms of these kinases provided further support to this finding. Interestingly, the pharmacological inhibition of PI3K, hindered the capacity of U-II to induce a pro-angiogenic effect on HUVEC, indicating that the PI3K/Akt pathway is also involved in regulating the process. It has also to be observed that some of the signalling pathways activated as a consequence of the binding of U-II to UT can, in principle, be started in several ways. In fact GPCR can also indirectly activate them by inducing the synthesis and release of growth factors. In this respect, the stimulation of HUVEC with U-II for 24 hours, induced AM, ET-1 and VEGF expression, as mRNA and proteins. All these factors are characterized by well known pro-angiogenic properties. Therefore U-II can also act indirectly by stimulating in HUVEC the expression of other pro-angiogenic factors. Altogether, the results of the present study suggested that U-II, in addition to regulating cardiovascular function, also exerts a direct action on the development and remodelling of the vascular network.

Urotensina-II (U-II) è un peptide ciclico, originariamente isolato dall’urofisi del pesce Gillichthys mirabilis, la cui isoforma umana (hU-II) è costituita di 11 aminoacidi. hU-II matura è sintetizzata da un precursore più grande, la prepro-U-II, il cui mRNA è stato individuato in vari tessuti. U-II è stata identificata quale ligando endogeno di uno specifico recettore ad alta affinità, il recettore orfano GPR14 che è stato successivamente rinominato UT. L’isoforma umana di UT appartiene alla classe A della superfamiglia di recettori accoppiati alle proteine G (GPCR). Il principale ruolo fisiologico di U-II nei mammiferi si esplica a livello del sistema cardiovascolare, dove il peptide esercita un notevole effetto ipertensivo e vasocostrittore e proprio per questo molti dati suggeriscono che U-II possa essere coinvolta nella regolazione del sistema cardiovascolare in condizioni sia fisiologiche che patologiche. In cellule endoteliali (EC) di origine animale sembra esercitare un chiaro effetto pro-angiogenico, ma pochi dati sperimentali sono attualmente disponibili per chiarire le azioni del peptide sull’endotelio vascolare umano. In questo lavoro modelli in vitro basati sull’uso di cellule endoteliali vascolari umane isolate direttamente da vasi diversi, quali vena safena (HSVEC), vena giugulare (HJVEC), vena ombelicale (HUVEC) e aorta (HAEC), sono stai utilizzati per caratterizzare vari aspetti del profilo pro-angiogenico di U-II. Analisi di RT-PCR ed immunocitochimica indicano che UT è espresso da tutte le EC umane considerate, mentre l’espressione di U-II risulta eterogenea, infatti il peptide si ritrova solo nelle HUVEC e nelle HAEC. Sottoposte a coltura su Matrigel, tutte le EC analizzate presentano una forte risposta angiogenica al peptide, con conseguente formazione di una rete di strutture capillaro-simili di maggiore densità e complessità rispetto alla situazione di controllo. L’effetto è comparabile a quello indotto da FGF-2 ed è antagonizzato da Palosuran, antagonista specifico di UT, ad indicare che l’attività del peptide è innescata dal legame con il suo recettore funzionale. E’ stato interessante notare che nelle EC derivate da vasi adulti questa azione non è associata ad un effetto proliferativo. Al contrario, U-II induce un moderato ma significativo aumento della proliferazione cellulare nelle HUVEC. Esperimenti condotti in presenza di specifici inibitori di vari step della cascata di segnalazione intracellulare dimostrano che l’auto-organizzazione in strutture capillaro-simili delle EC indotta da U-II è PKC-dipendente e coinvolge l’attivazione del pathway di trasduzione di ERK1/2. Analisi di western blot sulle forme fosforilate di queste chinasi hanno confermato i dati ottenuti con il Matrigel. Inoltre, l’inibizione farmacologica di PI3K, ostacola la capacità di U-II di indurre un effetto pro-angiogenico nelle HUVEC, indicando che anche il pathway PI3K/Akt potrebbe essere coinvolto nella regolazione del processo. E’ da considerare che alcuni pathway attivati come conseguenza del legame di U-II ad UT, potrebbero essere innescati in diversi modi. Infatti, i GPCR potrebbero anche attivarli indirettamente inducendo la sintesi ed il rilascio di fattori di crescita. A questo proposito, si è messo in evidenza come, dopo 24 ore di stimolazione, U-II induca nelle HUVEC l’espressione di AM, ET-1 e VEGF, tutti fattori con proprietà pro-angiogeniche note. A tempi più lunghi, quindi, U-II potrebbe anche agire indirettamente stimolando nelle HUVEC l’espressione di altri fattori pro-angiogenici. I risultati di questo lavoro suggeriscono quindi che U-II, oltre a regolare la funzionalità cardiovascolare, potrebbe anche esercitare un’azione diretta sullo sviluppo e il rimodellamento vascolare.