Characterization of the t(6;11)(q27;q23) in pediatric acute myeloid leukemia

Acute myeloid leukemia (AML) set up for the 10 % of pediatric leukemias. Patient genetic background has been demonstrated to be the most important feature for a correct management of patient diagnosis and prognosis. To date just 40 % of AML shows typical molecular markers with clinical impact, thus for the most of them new genetic alterations might be evaluated in order to achieve a better patients stratification and a deeper understanding of leukemogenesis. In the AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica) LAM-2002/01 treatment protocol, children affected by acute myeloid leukemia (AML) were stratified by using a risk group classification based on a combination of specific genetic abnormalities and response to treatment. Samples from 741 AML patients collected from 2000 to 2008 were investigated for their biological and clinical significance. MLL rearrangements were identified in 77/741 patients (10.4 %), with significantly different clinical outcomes depending on the MLL translocation partner. GEP analysis defined significant gene expression signatures dependent on the MLL-partner gene. Array-CGH analysis established high levels of DNA amplification (75 %) with respect to deletions (25 %) for MLL-AML, and the del(12p) to be considered as a novel feature for leukemia stratification. The t(6;11)(q27;q23) translocation is characterized by MLL-AF6 expression, a bad prognostic marker in AML; however, the exact tumorigenic mechanism is still unclear. Patients with MLL-AF6 displayed an adverse outcome, a specific GEP signature, as well as the highest DNA imbalances with additional recurrent genomic rearrangements in 12p, 11q and 6q. AF6 gene has no similarities with other MLL-partner genes and encodes for a cytoplasmatic protein involved in signal transduction. The chimeric protein, instead, has a nuclear localization, where it can homodimerize to activate transcription. The RAS pathway is often implicated in MLL-leukemia and AF6 was shown to inhibit RAS signaling in epithelial cells. Here, by immunofluorescence and immunoprecipitation analyses, the AF6-RAS interaction was demonstrated in bone marrow cells of healthy donors, while in t(6;11)(q27;q23) leukemic cell lines AF6 protein resulted sequestrated into the nucleus. Silencing for AF6 gene in healthy samples caused the overexpression of the RAF/MEK/ERK pathway proteins, confirming the RAS-inhibiting role of AF6 in hematopoietic cells. Specific silencing of MLL-AF6 in leukemic cells resulted in AF6 liberation into cytoplasm, where it colocalized with RAS effecting its downstream targets. By reverse phase protein array, cytoplasmic AF6 restoration was shown to improve expression of pro-apoptotic proteins PARP and CASPASE7 in leukemic cells and to diminish levels of P-CREB, mTOR, P-JAK and CYCLINs, involved in cell proliferation. As a result, reduced cell colony formation in semisolid medium was observed, accompanied with an augmented percentage of cell mortality. The same effects were obtained with two specific MEK inhibitors, confirming the RAS pathway implication in MLL-AF6-leukemia. These results suggest a possible mechanism by which MLL-AF6 acts in AML: the loss of RAS-inhibition by AF6 nuclear sequestration could be responsible for the proliferation advantage to t(6;11)(q27;q23) cells, enhancing the effect of the chimera in AML development.

Le leucemie acute mieloidi (LAM) costituiscono il 10 % delle leucemie pediatriche e l'assetto genetico del paziente è oggigiorno alla base della scelta del percorso terapeutico più adatto, rivestendo un ruolo fondamentale durante la fase diagnostica. Poiché attualmente circa il 40 % dei pazienti LAM presenta un marcatore molecolare riconoscibile, la ricerca in questo campo è tesa verso la scoperta di nuove anomalie che permettano una migliore classificazione dei pazienti e una più profonda comprensione del processo di leucemogenesi. Secondo il protocollo di trattamento LAM-2002/01 dell’AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica), i bambini affetti da leucemia acuta mieloide (LAM) sono stati stratificati in classi di rischio in base a una combinazione di specifiche anomalie genetiche e risposta al trattamento. I campioni prelevati da 741 pazienti LAM raccolti nel periodo 2000-2008 sono stati studiati per il loro significato biologico e clinico. Riarrangiamenti del gene MLL sono stati identificati in 77/741 pazienti (10.4 %), con risultati clinici molto diversi a seconda del partner di traslocazione di MLL. Un’analisi di GEP ha definito significativi pattern di espressione genica dipendenti dal gene partner di MLL. Mediante un’analisi di Array-CGH è stato stabilito che le LAM caratterizzate da riarrangiamenti del gene MLL si riscontra una maggior quantità di amplificazioni del DNA (75 %) rispetto alle delezioni (25 %) e che la delezione del(12p) può essere considerata una nuova caratteristica per la stratificazione delle leucemie. La traslocazione t(6;11)(q27;q23) è caratterizzata dall’espressione di MLL-AF6, un marcatore di cattiva prognosi nella LAM, sebbene l'esatto meccanismo oncogeno non sia ancora chiaro. I pazienti MLL-AF6 mostrano un esito particolarmente sfavorevole, uno specifico profilo di espressione genica, così come il più alto numero di sbilanciamenti cromosomici con riarrangiamenti genomici aggiuntivi ricorrenti in 12p, 11q e 6q. Il gene AF6 non ha analogie con altri geni partner di MLL e codifica per una proteina citoplasmatica coinvolta nella trasduzione del segnale. La proteina chimerica, invece, ha una localizzazione nucleare, dove può omodimerizzare per attivare la trascrizione. Il pathway di RAS è spesso implicato nelle leucemie caratterizzate da MLL ed è stato dimostrato che AF6 è in grado di inibire la trasmissione del segnale a valle di RAS in cellule epiteliali. In questo studio, mediante analisi di immunofluorescenza e immunoprecipitazione, l'interazione AF6-RAS è stata dimostrata in cellule di midollo osseo di donatori sani, mentre in linee cellulari leucemiche con la traslocazione t(6;11)(q27;q23) la proteina AF6 è sequestrata nel nucleo. Il silenziamento del gene AF6 in campioni sani ha causato la sovraespressione delle proteine del pathway RAF/MEK/ERK, confermando il ruolo inibitorio di AF6 su RAS nelle cellule ematopoietiche. Il silenziamento specifico di MLL-AF6 in cellule leucemiche ha comportato la liberazione di AF6 nel citoplasma, dove colocalizza con RAS con un effetto sui suoi effettori a valle. Mediante la tecnica del reverse phase protein array è stato visto che il ritorno di AF6 nel citoplasma in cellule leucemiche ha portato all’aumento dell'espressione delle proteine pro-apoptotiche PARP e CASPASI7 e alla diminuzione dei livelli di P-CREB, mTOR, P-JAK e CICLINE, coinvolte nella proliferazione cellulare. Di conseguenza, è stata osservata una ridotta formazione di colonie in terreno semisolido, accompagnata da una aumentata percentuale di mortalità cellulare. Gli stessi effetti sono stati ottenuti con due inibitori specifici di MEK, confermando l'implicazione del pathway di RAS nella leucemia MLL-AF6. Questi risultati suggeriscono un possibile meccanismo attraverso il quale MLL-AF6 agisce nella LAM: la perdita di inibizione di RAS tramite il sequestro nucleare di AF6 potrebbe essere responsabile del vantaggio proliferativo delle cellule t(6;11)(q27;q23), aumentando l'effetto della chimera nello sviluppo della LAM.