Resistenza all'aspirina in pazienti affetti da Policitemia Vera e Trombocitemia Essenziale: caratteristiche biomolecolari e della funzionalità piastrinica.

INTRODUCTION Low-dose aspirin (100mg/die) prevents thrombotic events by 22%, improving the survival probability of those subjects who have suffered from cardiovascular problems. However, literature reports that about 25% of the subjects treated with aspirin, presents thromboembolic events (aspirin resistance). Some Authors describe a “pharmacologic resistance”, that is intended when the drug is not able to effectively inhibit platelet aggregation and thromboxane production. Aspirin resistance causes are not well understood yet, they include: non-compliance of patients, incomplete absorption of the drug, lack of inhibition of COX-1, genetic alterations of glycoprotein IIIa (GPIIIa) (HPA-1). Patients affected by myeloproliferative neoplasms (MPN) are at risk for thromboembolic complications and ECLAP study showed that 100 mg/die of aspirin are also effective in these patients for the prevention of cardiovascular events. Almost all patients with polycythemia vera (PV) and about half of those with essential thrombocythemia (ET) are carriers of the acquired mutation in Janus kinase 2 gene (JAK2); this mutation substitutes a phenylalanine with a smaller valine in position 617 of exon 14 (V617F). This mutation appears to be a prothrombotic risk factor for MPN patients. AIM OF THE STUDY The aim of our study was to determine if clinical and/or pharmacological resistance to aspirin may also occur in patients with MPN. We analyzed genetic variations, in particular JAK2V617F mutation and HPA-1 polymorphism, to evaluate the correlation with aspirin resistance. Subsequently, we tested the utility of platelet aggregation and serum thromboxane (TxB2) assay to detect the non-responsiveness to aspirin in these particular patients. PATIENTS AND METHODS We studied 83 MPN patients treated with aspirin (100mg/die) (MPN in ASA), 40 patients with MPN diagnosis without aspirin treatment (MPN basal), 50 hospitalizes patients treated with aspirin (100mg/die) (Controls in ASA) and 42 healthy subjects (Controls). We used an allele-specific PCR for JAK2V617F mutation and a real-time PCR allelic discrimination for HPA-1 polymorphism. Pharmacological resistance was studied using Born’s platelet aggregation induced by arachidonic acid (AA), and ELISA assay for serum thromboxane B2 (TxB2). Differences in genotyping distribution between different groups of patients were assessed by χ2 test or Fisher exact test. We then created a ROC curve to obtain a TxB2 cut-off value. All the statistical analysis was performed using the software GraphPad Prism5, p<0.05 was considered statistically significant. RESULTS The JAK2V617F mutation was found in 90.1% of PV patients and in 75.6% of ET. The incidence of JAK2V617F mutation in MPN treated and untreated with aspirin was not statistically different. The incidence of thrombotic complications was not statistically different between cases carrying or not JAK2V617F mutation (p = 0.15). Among the 25 patients, who suffered from thrombotic complications, 23 (92%) were carriers of the JAK2V617F mutation while the mutation was present in 71% of cases without thrombotic complications (p = 0.0172). The b allele (HPA-1) frequency was similar in the MPN who have or have not developed thrombosis (p = 0.46). Two of 83 patients (2.4%), treated with ASA have a history of thromboembolic events during treatment. All Controls in ASA (100%) had an aggregation curve suppressed (<10%), while 22 MPN in ASA (26.5%) had aggregation curves not suppressed (80 ± 16%). Neither the presence of the JAK2V617F mutation, nor of the b allele influence the response to aspirin based on the results of aggregation (p = 0.8 and p = 0.42). There was no statistical difference in levels of serum TxB2 between Controls and MPN basal (p=0.75) or between the MPN in ASA and Controls in ASA. MPN basal serum TxB2 levels were significantly higher than those of MPN in ASA (p = 0.0414) and Control levels were significantly higher than Controls in ASA (p <0.0001). Normalizing values based on the number of platelets, no difference was found between Controls and MPN basal (p = 0.5); values of Controls released TxB2 were significantly higher than in Controls in ASA (p = 0.019). Similarly, between MPN basal and MPN in ASA the levels of TxB2 significantly decreased (p <0.0001), but the MPN in ASA showed higher levels than Controls in ASA (p <0.0001). Through the creation of a ROC curve, it was determined that the value of TxB2 948 pg / plts x 10 -8 was the cut-off to distinguish patients whose aspirin determines effective suppression of TxB2 values. None of the Controls and of MPN basal showed a TxB2 value of less than 948 pg / plts x 10 -8, while among the Controls in ASA and MPN in ASA, 2/21 (9.5%) and 37/77 (48%) respectively, showed levels higher than cut-off (aspirin resistant). 18 MPN in ASA (25%) showed a normal aggregation curve and high levels of TxB2, despite the use of aspirin (aspirin resistant). The 2 patients, who developed thrombotic complications during therapy with aspirin, both presented TxB2 levels higher than 948, but only one showed a normal aggregation curve. CONCLUSIONS JAK2V617F mutation is present in almost all patient with thrombotic events. The presence of rare allele b of HPA-1 does not appear to be correlated with thrombotic complications in patients with MPN. There seems to be no relationship between the presence of JAK2 mutation or b allele and resistance to aspirin. Aspirin resistance is not different between MPN patients and general population. Platelet aggregation, induced by AA, can identify aspirin resistance in approximately 25% of patients with MPN. The cut-off capable of establishing the non-suppression of TxB2 by aspirin is 948 pg / plts x 10 -8. Serum TxB2 levels higher than 948 pg / plts x 10 -8 indicate that aspirin does not completely inhibit thromboxane production. Serum TxB2 ELISA assay can identify aspirin resistance in about 50% of MPN patients. No relationship was recognized between clinical resistance and pharmacological resistance.

INTRODUZIONE L’uso di aspirina a basse dosi (100mg/die) previene gli eventi trombotici migliorando del 22% la probabilità di sopravvivenza dei soggetti che hanno sofferto di problemi cardiovascolari. Tuttavia, si stima che circa un quarto dei soggetti in terapia vadano ugualmente incontro a manifestazioni tromboemboliche (resistenza all'aspirina). E’ descritta anche un resistenza farmacologica, quando cioè il farmaco non è in grado di inibire efficacemente l’aggregazione piastrinica e la produzione di trombossano. Le cause della resistenza non sono ancora ben chiare: sono state prese in considerazione la non-compliance dei pazienti, l'incompleto assorbimento del farmaco, la mancata inibizione di COX-1, le alterazioni genetiche della Glicoproteina IIIa (GPIIIa) (HPA-1). Anche i soggetti affetti da neoplasie mieloproliferative (MPN) sono a rischio di complicanze tromboemboliche e lo studio ECLAP ha dimostrato che 100 mg/die di aspirina sono efficaci anche in questi pazienti per la prevenzione di eventi cardiovascolari. La quasi totalità dei pazienti affetti da policitemia vera (PV) e circa la metà di quelli con trombocitemia essenziale (ET) sono portatori della mutazione puntiforme ed acquisita a carico del gene della Janus Kinasi 2 (JAK2); la mutazione sostituisce con una fenilalanina una valina di piccole dimensioni in posizione 617 dell’esone 14 (V617F). Tale mutazione sembra essere un fattore di rischio protrombotico per i pazienti affetti da MPN. SCOPO DELLO STUDIO L'obiettivo principale del nostro studio è stato determinare se effettivamente la resistenza clinica e/o farmacologia all'aspirina si verifichi anche nei pazienti affetti da MPN. Si è inoltre cercata una correlazione tra resistenza all’aspirina e alcune variazioni genetiche, in particolare la mutazione JAK2V617F e il polimorfismo HPA-1. Abbiamo valutato infine l’utilità dell’aggregazione piastrinica e del dosaggio del trombossano (TxB2) sierico per riconoscere la non-responsività all’aspirina in questi particolari pazienti. PAZIENTI E METODI Sono stati studiati 83 pazienti affetti da MPN in terapia con aspirina (100mg/die) (MPN in ASA), 40 pazienti con MPN alla diagnosi non ancora in trattamento (MPN basali), 50 pazienti in terapia con aspirina (100mg/die) (Controlli in ASA) e 42 soggetti sani (Controlli). E’ stata ricercata la mutazione JAK2 V617F mediante PCR allele-specifica. Il polimorfismo HPA-1 è stato ricercato con discriminazione allelica in real time PCR. La resistenza farmacologica è stata studiata con aggregazione indotta da acido arachidonico (AA) secondo metodo di Born e il dosaggio del trombossano B2 (TxB2) sierico con metodica ELISA. Le differenze nella distribuzione genotipica tra i diversi gruppi di pazienti sono state valutate mediante test del χ2 e test di Fisher. Si è utilizzata una curva ROC per determinare un valore di cut-off per i livelli di TxB2. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate mediante il software GraphPad Prism5, considerando come soglia di significatività p<0.05. RISULTATI La mutazione JAK2V617F è stata trovata nel 90.1% dei pazienti affetti da PV e nel 75.6% dei casi con ET. L’incidenza della mutazione JAK2V617F negli MPN trattati e non trattati con aspirina non era statisticamente diversa. L’incidenza delle complicanze trombotiche non è statisticamente maggiore nei casi portatori di mutazione JAK2V617F (p=0.15). Dei 25 pazienti che hanno sofferto di complicanze trombotiche, 23 (92%) erano portatori della mutazione JAK2V617F mentre la mutazione era presente nel 71% dei casi senza complicanze trombotiche (p=0,0172). La frequenza dell’allele b di HPA-1 è stata comparabile negli MPN che hanno o non hanno sviluppato trombosi (p=0,46). Due degli 83 pazienti (2,4%) che erano in terapia con ASA hanno sofferto di eventi tromboembolici durante il trattamento. Tutti i Controlli in ASA (100%) mostravano una curva di aggregazione soppressa (< 10%), mentre 22 MPN in ASA (26,5%) avevano curve di aggregazioni non soppresse (80±16%). Né la presenza della mutazione JAK2V617F nè quella dell’allele b influenzano la risposta all’aspirina in base ai risultati dell’aggregazione (p=0.8 e p=0.42). Non è stata trovata alcuna differenza statistica nei livelli di TxB2 sierico tra i Controlli e gli MPN basali (p=0,75), né tra gli MPN in ASA e i Controlli in ASA. Gli MPN basali hanno livelli di TxB2 sierico significativamente maggiori di quelli in ASA (p=0,0414) e i Controlli significativamente superiori ai Controlli in ASA (p<0,0001). Normalizzando i valori in base al numero di piastrine, non è stata trovata differenza tra Controlli ed MPN basali (p=0,5), mentre erano significativamente più elevati i valori di TxB2 rilasciato dai Controlli rispetto ai Controlli in ASA (p=0,019). Analogamente, i livelli di TxB2 si riducono dopo trattamento con aspirina nei pazienti MPN (p<0,0001); tuttavia, gli MPN in ASA mostrano livelli significativamente più elevati rispetto ai Controlli in ASA (p<0,0001). Con la costruzione di una curva ROC, si è stabilito che il valore di TxB2 948 pg/plts x 10-8 rappresenta il cut-off per distinguere i pazienti in cui la terapia con ASA determina efficace soppressione dei valori di TxB2. Nessuno dei Controlli e degli MPN basali mostrava un valore di TxB2 inferiore a 948 pg/plts x 10-8, mentre tra i Controlli in ASA e gli MPN in ASA, 2 /21 (9,5%) e 37/77 (48%) rispettivamente, mostravano livelli maggiori del cut-off (resistenti). 18 MPN in ASA (25%) aggregavano normalmente e presentavano livelli di TxB2 elevato malgrado l’uso di aspirina (resistenti all'aspirina). I 2 casi che hanno sviluppato complicanze trombotiche durante la terapia con aspirina avevano livelli di TxB2 maggiori di 948, ma solo in uno di essi l’aggregazione era soppressa. CONCLUSIONI La mutazione JAK2V617F è risultata presente nella quasi totalità dei pazienti con eventi trombotici. La presenza dell’allele raro b di HPA-1 non sembra correlabile con le complicanze trombotiche dei pazienti con MPN. Non sembra esistere alcuna relazione tra la presenza di mutazione JAK2 o dell'allele b e la resistenza all’aspirina. La resistenza all’aspirina non è diversa nei pazienti affetti da MPN e nella popolazione generale. L’aggregazione piastrinica indotta da AA è risultata capace di identificare la resistenza all’aspirina in circa il 25% dei pazienti con MPN. Il cut-off capace di stabilire la mancata soppressione del TxB2 da parte dell’aspirina è di 948 pg/plts x 10-8. Un livello superiore a 948 pg/plts x 10-8 di TxB2 stabilisce la mancata inibizione della produzione di trombossano da parte dell’aspirina. Il dosaggio del TxB2 è risultato capace di identificare la resistenza all’aspirina in circa la metà dei pazienti con MPN. Non è stata riconosciuta alcuna relazione tra la resistenza clinica e la resistenza farmacologica.