Structural studies of Helicobacter pylori proteins relevant for gastric colonization

Gastric cancer is the second leading cause of cancer death worldwide. This is in part a consequence of the increased human longevity, although the rate of gastric cancer has actually been declining from the early 20th Century. Since the relationship between H. pylori and chronic gastritis was established, investigators began to take interest in the role played by H. pylori in this type of cancer. From the first studies to examine this association, several epidemiological data have confirmed the relationship between the regional prevalence of H. pylori and the incidence of stomach cancer. H. pylori is a Gram-negative spiral-shaped bacterium that is characterized by two aspects: the use of several unipolar flagella that confer motility and its ureasic activity. H. pylori is a highly variable bacterial species, both genotypically and phenotypically, and is highly adapted for survival in the gastric niche. The development of effective treatment options to eradicate the H. pylori infection has resulted in an immense change in the clinical management of upper gastrointestinal diseases. The wide use of antibiotic therapies against H. pylori infection, however, is related to the number of therapeutic failures. Recent data show a decreasing efficacy of these therapies worldwide. The research for new therapeutic strategies and new drugs is necessary. The project presented here aims to determine not only the three dimensional structure of proteins playing a role in the virulence of the bacterium, but also their analysis and characterization using an approach of structural genomics. The three-dimensional structure of a protein, in addition to clarify its function, may be useful for the design of potential new drugs. This thesis presents several potential drug targets, each consisting of proteins involved in pathogenicity or essential to the survival of the bacterium. All genes were cloned as described by using different strategies; 7 out of 9 proteins were expressed, 3 out of 7 were soluble in an heterologous enviromen; these three proteins were structurally characterized, two with a crystallographic approach and one with SAXS. The results of the studies on the latter three proteins are presented in detail: CagL, a protein belonging to cagPAI; HP1286, a periplasmic protein belonging to the family YceI that is induced by osmotic stress created by high NaCl or high acidity; and finally HP0797, an adhesin. CagL is a protein localized on the surface of the pilus and acts as a specialized adhesin that connects the T4SS with target cells. The integrin complex α5β1 binds to a small protein of 26 kDa, CagL precisely, which is encoded by the gene hp0539 of the cagPAI. CagL seems to be a functional ortholog of VirB5, a structural component of the T4SS of Agrobacterium tumefaciens. In this thesis we propose a structural model of the oligomerization state of CagL in solution, using the technique of small angle x-ray scattering (SAXS). This model is supported by other experiments, such as crosslinking and gel filtration. Regarding the HP1286 enzyme, crystals were grown and diffraction data measured. Crystals belong to space group P212121 and contain a dimer per asymmetric unit. Each monomer has a hydrophobic pocket in which there is an electron density indicating the presence of a ligand. The latter was identified by mass spectrometry as erucamide, the amide of a fatty acid of 22 carbon atoms, erucic acid (Z-CH3 (CH2) 7CH = CH (CH2) 11CONH2). The recombinant protein HpaA (HP0797), an adhesin, was expressed in E. coli in soluble form without the signal peptide. We have obtained crystals that diffract only at a resolution of 4 Å and attempts to improve them are in progress. A molecular model was built by homology modelling and the putative domain of glycolipids of HpaA was predicted based on its amino acid sequence.

Il tumore gastrico è la seconda causa di morte per cancro nel mondo. Questo fatto è in parte una conseguenza della maggiore longevità umana, anche se il tasso di cancro gastrico è effettivamente in calo rispetto ai primi anni del 20° secolo. Da quando è stata stabilita una relazione tra H. pylori e gastrite cronica, i ricercatori hanno cominciato ad interessarsi al ruolo svolto da H. pylori in questi tipi di tumore. Dai primi studi volti ad esaminare tale associazione, numerosi dati epidemiologici hanno confermato la relazione tra la prevalenza regionale di H. pylori e l'incidenza dei tumori allo stomaco. H. pylori è un batterio Gram-negativo a forma di spirale che si caratterizza per due aspetti: l’utilizzo di numerosi flagelli unipolari che gli conferiscono motilità e l’attività ureasica. H. pylori è una specie batterica altamente eterogenea, sia genotipicamente che fenotipicamente, che si è adattata alla sopravvivenza nella nicchia gastrica. Diversi aspetti della biologia delle adesine di H. pylori esemplificano l'importanza dell’eterogeneità in questo sistema: (i) nessuna adesina in particolare è essenziale per il fissaggio alla mucosa gastrica, il che indica la ridondanza del meccanismo adesivo; (ii) l’espressione delle adesine è diversificata tra ceppi ed è variabile nel tempo all'interno di un unico ceppo; (iii) le interazioni adesive contribuiscono all'infiammazione ed è probabile che siano coinvolte nella progressione della malattia. Lo sviluppo di diversi trattamenti per sradicare l'infezione da H. pylori si è tradotto in un enorme cambiamento nella gestione clinica delle patologie del tratto gastrointestinale superiore. L'ampio uso di terapie antibiotiche contro l'infezione da H. pylori è, però, correlato al numero di fallimenti terapeutici. Dati recenti mostrano una diminuzione dell'efficacia di queste terapie in tutto il mondo. Ciò ha reso necessaria la ricerca di nuove strategie terapeutiche e di nuovi farmaci. Il progetto qui presentato mira a determinare non solo la struttura tridimensionale delle proteine descritte, ma anche la loro analisi e caratterizzazione attraverso un approccio di genomica strutturale. La struttura tridimensionale di una proteina, infatti, oltre a chiarire le funzioni della proteina target, può essere utile per la progettazione di potenziali nuovi farmaci. In questa tesi vengono presentati diversi potenziali bersagli farmacologici, tutti consistenti in proteine coinvolte nella patogenicità o comunque essenziali per la sopravvivenza del batterio. Tutti i geni descritti sono stati clonati utilizzando strategie diverse; 7 su 9 proteine sono state espresse, 3 su 7 sono risultate solubili in ambiente eterologo; queste tre proteine sono state infine caratterizzate strutturalmente: due con approccio cristallografico ed una con SAXS. Sono presentati in dettaglio i risultati degli studi su queste ultime tre proteine: CAGL, una proteina appartenente alla cagPAI; HP1286, una proteina periplasmatica appartenente alla famiglia YceI che è indotta da stress osmotico creato da elevato NaCl o da elevata acidità; infine HP0797, un’altra adesina. CAGL è una proteina presente sulla superficie del pilus e funge da adesina specializzata che collega il T4SS con le cellule bersaglio. Il complesso di integrine α5β1 si lega ad una piccola proteina di 26 kDa, CAGL appunto, che è codificata dal gene hp0539 della cagPAI. CAGL sembra essere un ortologo funzionale di VirB5, un componente strutturale del T4SS di Agrobacterium tumefaciens. In questa tesi viene proposto un modello strutturale dello stato di oligomerizzazione di CAGL in soluzione, utilizzando la tecnica di “small angle x-ray scattering” (SAXS). Questo modello viene supportato da numerosi esperimenti, quali crosslinking e gel filtrazione. Per l’enzima HP1286 sono stati ottenuti cristalli ed i dati di diffrazione sono stati misurati. I cristalli appartengono al gruppo spaziale P212121; essi contengono un dimero per unità asimmetrica. Ogni monomero presenta una tasca idrofobica nella quale c’è una densità elettronica che indica la presenza di un ligando. Quest’ultimo è stato identificato dalla spettrometria di massa, come erucamide, l’ammide di un acido grasso di 22 atomi carbonio, acido erucico (Z-CH3 (CH2) 7CH = CH (CH2) 11CONH2). La proteina ricombinante HpaA (HP0797), un’adesina, è stata espressa in E. coli in forma solubile, senza il peptide segnale. Si sono ottenuti cristalli che per ora diffrangono solo alla risoluzione di 4 Å e si sta cercando di migliorarli. Il putativo dominio glicolipidico della HpaA è stato predetto sulla base dalla sequenza aminoacidica. La struttura atomica HpaA potrebbe essere utilizzata anche per caratterizzare i domini glicolipidici in proteine che sono racchiuse in un guscio di lipidi.