Involvement of TGF-?1 in Multimerin-2, but not Emilin-2 regulation of blood pressure

Emilins are a family of extracellular matrix (ECM) glycoproteins characterized by a cysteine-rich N-terminal EMI domain. The family comprises four members in mammals: Emilin-1, Emilin-2, Multimerin-1 and Multimerin-2. The prototype of this family is Emilin-1, a protein widely distributed in interstitial connective tissue in association with elastic fibers and strongly expressed in the mouse cardiovascular system during development and in the adult. Emilin1 knockout animals display increased blood pressure, increased peripheral vascular resistance, and reduced size of arterial tunica media. The mechanism that brings about this phenotype entails an increase of TGF-?1 signalling with consequences on vascular SMC growth, ECM homeostasis, and vascular remodelling. It has been found that Emilin-1, through its EMI domain, binds proTGF-?1 and prevents its maturation by proprotein convertases. Therefore, Emilin-1 has an important role in the regulation of TGF-? extracellular availability. To gain insight into the function of two other members of the Emilin family, Emilin2 and Mmrn2, knockout mice for these genes were generated. Both genes are expressed mainly in the cardiovascular system: during development Emilin-2 was mainly found in the heart and blood vessels of the central nervous system, while in the adult it was detected in lymphoid organs and, with fainter staining, in heart and kidney. The expression of Multimerin-2 was restricted to endothelium. The pattern of expression of these genes and the high sequence similarity with Emilin-1 (particularly in EMI domain) stimulated the analysis of the phenotype of the cardiovascular system in mutant mice. Mmrn2 and Emilin2 knockout mice were found to be hypertensive. For Multimerin-2 this alteration is accompanied by a mild reduction of the media cross-sectional area, whereas this is not the case for Emilin-2. Moreover, Mmrn2 null mice exhibit an increased contraction of resistance vessels in response to the adrenergic ?1 agonist phenylephrine. On the contrary, the response of Emilin2-/- blood vessels to this drug was normal. Molecular mechanisms by witch Emilin-2 and Multimerin-2 carry out their physiological function in blood vessels were studied through in vivo and in vitro biochemical study. Evidences in vitro demonstrate that Emilin-2 and Multimerin-2 could reduce TGF-?1 signalling through the inhibition of proTGF-?1 processing into the LAP/TGF-? complex. This activity is mediated by the EMI domain and the formation of a supramolecular association of Emilins with proTGF-?1 (or the LAP/TGF-? complex) was demonstrated. The relevance of TGF-?1 in the pathogenesis of cardiovascular phenotype was tested by experiments in vivo, in which the TGF-?1 gene dosage was genetically reduced in Emilin2 and Mmrn2 null mice. The hypertensive phenotype was rescued in Mmrn2 knockout mice, while the blood pressure remained elevated in Emilin2 null animals. Different isoforms of TGF-? are expressed in the cardiovascular system during development and the inhibitory effect of Emilin-2 on TGF-?2 and -?3 signalling was demonstrated through in vitro assays. However, inactivation of a single TGF-?2 allele did not reverse the hypertensive phenotype of Emilin2-/- mice, indicating that TGF-?2 dysregulation is not involved in the pathogenesis of this phenotype. In conclusion the observations that Multimerin-2 produced by endothelial cells is able to regulate contractility of arterial vessels (due to vascular SMC) to adrenergic stimulation and that the hypertensive phenotype of null mice is caused by increased TGF-?1 signalling led to hypothesize that endothelial cells through expression of TGF-?1 regulate contractility of vascular SMC. Multimerin-2, localized between endothelial cells and vascular SMC, reduces the amount of TGF-?1 available to vascular SMC. Therefore, lack of Multimerin-2 gives rise to an increased signalling of TGF-?1 in vascular SMC that became more susceptible to sympathetic stimulation. Increased contractility of vascular SMC in small resistance vessels increases peripheral resistance and leads to hypertension. The cytostatic effect of TGF-?1 on vascular SMC and the consequent reduction in vessels size contribute to the generation of hypertensive phenotype. The mechanism of regulation of blood pressure by Emilin-2 remains to be elucidated. The role of TGF-?3 in blood pressure homeostasis supposed from data in vitro needs to be verified in vivo. The involvement of other members of the TGF-? family of growth factors will also be considered in the future.

Le Emiline costituiscono una famiglia di glicoproteine della matrice extracellulare caratterizzate dalla presenza, all’estremità amino-terminale, di un dominio ricco di cisteine, denominato EMI. Nei mammiferi la famiglia comprende 4 membri: Emilina-1, Emilina-2, Multimerina-1, Multimerina-2. Emilina-1 è il prototipo per questa famiglia ed è largamente distribuita, in associazione con le fibre elastiche, nei tessuti connettivi interstiziali. Il sito di maggior espressione di Emilina-1 è il sistema cardiovascolare, sia durante lo sviluppo embrionale, sia nell’adulto. Animali deficienti di Emilina-1 presentano una elevata pressione sanguigna associata ad un aumento delle resistenze vascolari periferiche ed una riduzione del diametro della tonaca media delle arterie. Il meccanismo che porta a questo fenotipo coinvolge un aumento di segnalazione di TGF-?1 con effetti riguardanti la crescita delle cellule muscolari lisce vascolari, l’omeostasi della matrice extracellulare e il rimodellamento vascolare. E’ stato dimostrato che Emilina-1, mediante il dominio EMI, lega il proTGF-?1 e previene la sua maturazione da parte di proprotein convertasi. Emilina-1 ha quindi un importante ruolo nella regolazione della disponibilità del TGF-? nell’ambiente extracellulare. Per comprendere la funzione di Emilina2 e Multimerina2 sono stati generati topi con un’inattivazione genica mirata di questi geni. Il sito di maggiore espressione di entrambi i geni è il sistema cardiovascolare. Durante lo sviluppo embrionale, Emilina-2 è principalmente presente nel cuore e nei vasi del sistema nervoso centrale mentre nell’adulto è stata trovata negli organi linfoidi e, in piccola quantità, nel cuore e nel rene. L’espressione di Multimerina-2 è invece ristretta agli endoteli. La distribuzione di queste proteine e la loro elevata omologia di sequenza con Emilina-1 (in particolare a livello del dominio EMI) hanno guidato l’analisi del fenotipo dei topi mutanti verso il sistema cardiovascolare. I topi deficienti di Emilina-2 e Multimerina-2 sono ipertesi. Per quanto riguarda Multimerina-2, il fenotipo ipertensivo è accompagnato da una leggera riduzione dell’area della tonaca media in sezione trasversale. Inoltre i topi deficienti di Multimerina-2 presentano un’aumentata contrattilità dei vasi di resistenza in risposta alla fenilefrina, un agonista dei recettori ?1 adrenergici. Nei topi deficienti di Emilina-2 invece questi due parametri risultano essere paragonabili ai topi di ceppo selvatico. I meccanismi molecolari attraverso i quali Emilina-2 e Multimerina-2 svolgono le loro funzioni fisiologiche nei vasi sanguigni sono stati studiati attraverso studi in vivo e studi biochimici in vitro. Questi ultimi hanno dimostrato che Emilina-2 e Multimerina-2 possono ridurre la segnalazione di TGF-?1 attraverso l’inibizione della trasformazione del proTGF-?1 nel complesso LAP/TGF-?. Questa attività, mediata dal dominio EMI, si sviluppa attraverso la formazione di un’associazione sovramolecolare con il proTGF-? (o il complesso LAP/TGF-?). L’importanza del TGF-?1 nella patogenesi del fenotipo cardiovascolare è stata testata attraverso esperimenti in vivo. Il dosaggio genico di TGF-?1 è stato geneticamente ridotto nei topi deficienti di Emilina-2 e Multimerin-2. Il fenotipo ipertensivo è stato perso dai topi con inattivazione del gene Multimerina2 mentre la pressione sanguigna rimane elevata nei topi in cui il gene Emilina2 è stato inattivato. Durante lo sviluppo embrionale, le diverse isoforme di TGF-? (TGF-?1, -?2 e -?3) sono espresse nel sistema cardiovascolare. Mediante saggi in vitro è stato dimostrato che Emilina-2 ha un effetto inibitorio anche sulla segnalazione di TGF-?2 e TGF-?3. Tuttavia, l’inattivazione di un allele di TGF-?2 in topi deficienti di Emilina-2 non porta alla perdita del fenotipo, indicando che una deregolazione della segnalazione di TGF-?2 non è coinvolta nella patogenesi di questo fenotipo. In conclusione, l’osservazione che Multimerina-2 prodotta dalle cellule endoteliali è in grado di regolare la contrazione delle arterie (dovuta alle cellule muscolari lisce vasali) in risposta alla stimolazione adrenergica e che il fenotipo ipertensivo è causato da un aumento della segnalazione di TGF-?1, porta ad ipotizzare che le cellule endoteliali, attraverso l’espressione di TGF-?1, possono regolare la contrattilità delle cellule muscolari lisce vasali. Multimerina-2, localizzata tra le cellule endoteliali e le cellule muscolari lisce, riduce la quantità di TGF-?1 disponibile per le cellule muscolari lisce. In conseguenza la mancanza di Multimerina-2 porta ad un aumento della segnalazione di TGF-?1 alle cellule muscolari lisce che diventano più sensibili alla stimolazione simpatica. Un aumento della contrattilità delle cellule muscolari lisce nei piccoli vasi di resistenza genera un aumento delle resistenze periferiche che portano quindi all’ipertensione. L’effetto citostatico del TGF-?1 sulle cellule muscolari lisce e la conseguente riduzione del calibro vasale contribuiscono alla generazione del fenotipo ipertensivo. Il meccanismo di regolazione della pressione sanguigna da parte di Emilina-2 rimane inspiegato. I dati in vitro lasciano supporre un ruolo del TGF-?3 nella regolazione della pressione sanguigna che deve però essere verificato in vivo. In futuro, inoltre, dovrà essere considerato anche il coinvolgimento di altri membri della famiglia dei TGF-?.