Biochemical and spectroscopic analysis of two key proteins involved in FeS-clusters biogenesis

FeS clusters are ancient prosthetic groups, widely diffused in almost all living beings in which they are involved in several fundamental metabolic pathways, including redox reactions, electron transfer, enzyme catalysis and many other functions. This assortment is reflected in the presence of several FeS clusters with different structures, from the simple rhombic 2Fe2S and cubic 4Fe4S clusters, to the highly complex 2Fe[4Fe4S] H-cluster (metal cofactor of [FeFe]-hydrogenases). Distinct biosynthetic pathways for the assembly of different FeS clusters exist, in both prokaryotic and eukaryotic microorganisms. In general, these are rather complex processes carried out by many proteins interacting with each other. While keeping some key peculiarities, these systems are highly conserved in terms of action strategy, which can be generally divided in two main steps: the assembly of the metal cofactor on a scaffold protein, and the subsequent transfer of the de novo generated FeS cluster from the scaffold to the acceptor apoprotein, which is eventually converted into the mature active holoprotein. Both steps require key scaffold proteins, that must be able to dynamically interact with the biosynthetic partners as well as with a combination of several chaperones and co-chaperones which participate into the final transfer of the prosthetic group to the recipient FeS protein. Thus, the structural features of scaffold proteins allowing their interactions with all the functional partners are key points. However, for many of these fundamental proteins a clear structure-function relationship characterization is missing, and a complete characterization of the whole complex multistep molecular pathways in which they are functionally involved need a deeper investigation. In this PhD thesis, two different FeS clusters biosynthetic systems have been studied: in Chapter 1), the [FeFe]-hydrogenases maturation system and in Chapter 2), the human mitochondrial FeS clusters biosynthetic system. Chapter 1) [FeFe]-hydrogenases are FeS proteins that in several prokaryotes as well as in unicellular green algae catalyze the reversible reduction of protons to hydrogen gas. Thus, they received an increasing attention for potential technological applications in the field of biological production of clean and renewable fuel. A specific and highly conserved biosynthetic system is required to assemble the complex [FeFe]-hydrogenases FeS cluster, the so-called H-cluster, which is composed by a 4Fe4S center linked to a 2Fe subcluster coordinated by CO and CN- ligands as well as to a bridging dithiolate. Despite the high complexity of this cofactor, its biosynthesis and transfer is carried out by only three specific proteins, working in combination with the FeS cluster housekeeping biogenesis machinery: HydE and HydG assemble the H-cluster on the scaffold protein HydF, a small GTPase which also drives the delivery of the complete cluster to the target apohydrogenase. Thus, HydF plays a central double role of FeS cluster scaffold and carrier protein in [FeFe]-hydrogenases maturation. Although several molecular and functional data have been obtained since the discovery of the HydE/HydF/HydG machinery, the whole biosynthetic process is still not completely characterized. The crystal structure of a recombinant HydF apoprotein was solved in my laboratory and suggested useful molecular insights into the protein function. On the other hand, several open issues remained, including the specific role of the HydF GTPase domain, which is essential for the [FeFe]-hydrogenase maturation and activation. Chapter 2). In mammals, FeS clusters are mainly present and synthetized in mitochondria. Their assembly is performed by a complex and highly conserved system involving several proteins. Among them, ISCU is the scaffold upon which FeS clusters are assembled at the so called SDU, which also includes the desulfurase NFS1, the accessory protein ISD11, and frataxin (FXN). FXN is an iron-binding protein (Fe2+ and Fe3+) whose specific role in this biosynthetic pathway is still controversial, as it was first proposed to be the iron donor of the process, and then an allosteric activator of the SDU complex. In humans, defects of both ISCU or FXN lead to diseases with distinct clinical phenotypes but similar cellular and biochemical features. Decreased levels of ISCU mitochondrial isoform caused by a point mutation of the ISCU gene lead to a rare myopathy with lactic acidosis (ISCU myopathy); decreased levels of FXN, due to an abnormal expansion of GAA trinucleotide repeat in the FXN gene, cause Friedreich’s Ataxia (FRDA), a neurodegenerative disorder. Cellular hallmarks of both diseases are compromised respiration, mitochondrial iron overload and increased sensitivity to oxidative stress, and for both a specific therapy is still missing. This may be due, at least in part, to an incomplete characterization of the pathway(s) in which these proteins are involved, and in particular it is worth to note that FXN is a protein still looking for a function. Based on these premises, I focused the work of my PhD on these two open issues by taking advantage, in both cases, of a combination of biochemical and spectroscopic approaches to assess structural features of 1) HydF GTPase domain and 2) FXN, both alone and in binary complex with the scaffold ISCU. In particular, to explore the HydF protein and its structural response to GTP binding, in collaboration with Prof. Carbonera (Department of Chemical Sciences Padova, University of Padova), I exploited an advanced spectroscopic technique, EPR (Electron Paramagnetic Resonance), that is the ultimate technique for the study of FeS proteins; to characterize into detail the FXN-ISCU direct interaction, I applied the two-dimensional NMR (Nuclear Magnetic Resonance) technique, in collaboration with Prof. Bellanda (Department of Chemical Sciences, University of Padova). Chapter 1). I carried out in vitro spectroscopic studies to characterize the HydF GTPase domain. The obtained results allowed me to conclude that HydF can be considered as a novel member of the K+-dependent GTPases. Thus, these proteins may have a larger spread of functions than supposed before. HydF could be a molecular switch undergoing significant structural modifications upon GTP binding, as other members of the same family. Moreover, diffuse conformational changes due to GTP binding were detected, and this could be pivotal for dynamic structural and functional interactions with the other proteins involved in [FeFe]-hydrogenase maturation and activation. Starting from this discovery, it will be possible to model the GTP-bound state of HydF, an important structural information which was missing in the X-ray structure of the apoprotein previously solved in our laboratory. Chapter 2). I performed biochemical and spectroscopic analysis of human FXN, alone and in complex with ISCU, that allowed me to identify in FXN the residues involved in the binding of Fe3+/2+ and in its interaction with ISCU, which a confirmed to be iron-dependent. Then, since many FXN residues that I found to be involved in the direct interaction with ISCU are mutated in patients with variants of FRDA, I evaluated if and how these mutations can interfere with ISCU-FXN direct interaction and with its capability to bind iron. I found that FRDA-related frataxin variants in which mutations are located in ISCU-binding region do not affect frataxin iron-binding properties, while impairing both the interaction with ISCU and the ability to activate the SDU complex. Other FRDA related frataxin variants, instead, in which mutations are located in the iron-binding region or between the latter and ISCU-binding region, affect, as expected, the capability of FXN to bind iron while not completely impairing its interaction with ISCU. Moreover, these FXN variants keep a partial capability to activate SDU complex. Taken together, these results open new perspectives in the study of the mechanisms leading to FRDA variants, and give additional hints useful to clarify the physiological role of FXN as well as its contribution to the pathogenesis of Friedreich’s ataxia.

I gruppi di FeS sono gruppi protesici ancestrali, ampiamente diffusi in quasi tutti gli esseri viventi in cui sono coinvolti in diverse vie metaboliche fondamentali, tra cui reazioni redox, trasferimento di elettroni, catalisi enzimatica e molte altre funzioni. Questo assortimento si riflette nella presenza di numerosi cluster FeS con diverse strutture, dai semplici cluster rombici 2Fe2S e 4Fe4S cubici, al complesso cluster 2Fe [4Fe4S] H (cofattore metallico di [FeFe] -idrogenasi). Esistono percorsi biosintetici distinti per l'assemblaggio di diversi gruppi di FeS, sia nei microrganismi procarioti che negli eucarioti. In generale, questi sono processi piuttosto complessi realizzati da molte proteine ​​che interagiscono tra loro. Pur mantenendo alcune peculiarità chiave, questi sistemi sono altamente conservati in termini di strategia d'azione, che può essere generalmente suddivisa in due fasi principali: l'assemblaggio del cofattore metallico su una proteina scaffold e il successivo trasferimento del cluster FeS de novo generato da l'impalcatura dell'apoproteina dell'accettore, che alla fine viene convertita nell'oloproteina attiva matura. Entrambi i passaggi richiedono proteine ​​chiave dello scaffold, che devono essere in grado di interagire dinamicamente con i partner biosintetici e con una combinazione di diversi chaperon e co-chaperon che partecipano al trasferimento finale del gruppo protesico alla proteina FeS ricevente. Pertanto, le caratteristiche strutturali delle proteine ​​dello scaffold che consentono le loro interazioni con tutti i partner funzionali sono punti chiave. Tuttavia, per molte di queste proteine ​​fondamentali manca una chiara caratterizzazione delle relazioni struttura-funzione, e una caratterizzazione completa dell'intero complesso percorso molecolare multistep in cui sono coinvolte funzionalmente necessita di un'indagine più approfondita. In questa tesi di dottorato, sono stati studiati due diversi sistemi di biosintesi di cluster FeS: nel Capitolo 1, il sistema di maturazione [FeFe] -idrogenasi e nel Capitolo 2), il FeS mitocondriale umano raggruppa il sistema biosintetico. Capitolo 1) [FeFe] -idrogenasi sono proteine ​​FeS che in diversi procarioti e in alghe verdi unicellulari catalizzano la riduzione reversibile dei protoni al gas idrogeno. Pertanto, hanno ricevuto una crescente attenzione per le potenziali applicazioni tecnologiche nel campo della produzione biologica di carburante pulito e rinnovabile. È necessario un sistema biosintetico specifico e altamente conservato per assemblare il cluster FeS (FeFe) -idrogenasi complesso, il cosiddetto cluster H, composto da un centro 4Fe4S collegato a un subcluster 2Fe coordinato da CO e ligandi CN quanto a un ponte ditiolato. Nonostante l'elevata complessità di questo cofattore, la sua biosintesi e trasferimento sono effettuati da sole tre proteine ​​specifiche, che funzionano in combinazione con il meccanismo di biogenesi del cluster FeS: HydE e HydG assemblano l'H-cluster sulla proteina scaffold HydF, una piccola GTPase che guida anche la consegna del cluster completo alla apoidrogenasi bersaglio. Pertanto, HydF svolge un duplice ruolo centrale nello scaffold di cluster FeS e nella proteina carrier nella maturazione di [FeFe] -idrogenasi. Sebbene diversi dati molecolari e funzionali siano stati ottenuti dalla scoperta dei macchinari HydE / HydF / HydG, l'intero processo biosintetico non è ancora completamente caratterizzato. La struttura cristallina dell' apoproteina ricombinante HydF è stata risolta nel mio laboratorio e ha suggerito utili informazioni molecolari sulla funzione proteica. D'altra parte, sono rimasti alcune questioni aperte, incluso il ruolo specifico del dominio GTPasico di HydF, che è essenziale per la maturazione e l'attivazione di [FeFe] -idrogenasi. Capitolo 2). Nei mammiferi, i cluster di FeS sono principalmente presenti e sintetizzati nei mitocondri. Il loro assemblaggio viene eseguito da un sistema complesso e altamente conservato che coinvolge diverse proteine. Tra questi, l'ISCU è lo scaffold su cui sono sintetizzati i cluster FeS nel cosiddetto SDU, che include anche la desulfurase NFS1, la proteina accessoria ISD11 e la fratassina (FXN). FXN è una proteina legante il ferro (Fe2 + e Fe3 +) il cui ruolo specifico in questo percorso biosintetico è ancora controverso, in quanto è stato inizialmente proposto come donatore di ferro del processo e quindi attivatore allosterico del complesso SDU. Negli esseri umani, i difetti di ISCU o FXN portano a malattie con fenotipi clinici distinti ma caratteristiche cellulari e biochimiche simili. Diminuzione dei livelli di isoforme mitocondriale ISCU causata da una mutazione puntiforme del gene ISCU portano a una rara miopatia con acidosi lattica (miopatia ISCU); livelli diminuiti di FXN, a causa di un'anomala espansione della ripetizione del trinucleotide GAA nel gene FXN, causano l'atassia di Friedreich (FRDA), una malattia neurodegenerativa. Le caratteristiche cellulari di entrambe le malattie sono la respirazione compromessa, il sovraccarico di ferro mitocondriale e l'aumento della sensibilità allo stress ossidativo, e per entrambi una terapia specifica è ancora mancante. Ciò può essere dovuto, almeno in parte, a una caratterizzazione incompleta del / i percorso / i in cui sono coinvolte queste proteine, e in particolare vale la pena notare che FXN è una proteina che sta ancora cercando una funzione. Sulla base di queste premesse, ho focalizzato il lavoro del mio dottorato su questi due problemi aperti sfruttando, in entrambi i casi, una combinazione di approcci biochimici e spettroscopici per valutare le caratteristiche strutturali di 1) dominio GTPase di HydF e 2) FXN, entrambi soli e nel complesso binario con l'impalcatura ISCU. In particolare, per esplorare la proteina HydF e la sua risposta strutturale al legame GTP, in collaborazione con il Prof. Carbonera (Dipartimento di Scienze Chimiche di Padova, Università di Padova), ho sfruttato una tecnica spettroscopica avanzata, EPR (Electron Paramagnetic Resonance), cioè la tecnica definitiva per lo studio delle proteine ​​FeS; per caratterizzare in dettaglio l'interazione diretta FXN-ISCU, ho applicato la tecnica bidimensionale NMR (Nuclear Magnetic Resonance), in collaborazione con il Prof. Bellanda (Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova). Capitolo 1). Ho effettuato studi spettroscopici in vitro per caratterizzare il dominio GTPasico di HydF. I risultati ottenuti mi hanno permesso di concludere che HydF può essere considerato un nuovo membro delle GTPasi dipendenti da K +. Pertanto, queste proteine ​​potrebbero avere una più ampia diffusione di funzioni rispetto a quanto supposto prima. HydF potrebbe essere un interruttore molecolare sottoposto a significative modifiche strutturali sul legame GTP, come altri membri della stessa famiglia. Inoltre, sono stati rilevati cambiamenti conformazionali diffusi dovuti al legame GTP, e questo potrebbe essere cruciale per interazioni strutturali e funzionali dinamiche con le altre proteine ​​coinvolte nella maturazione e attivazione di [FeFe] -idrogenasi. A partire da questa scoperta, sarà possibile modellare lo stato di HydF legato a GTP, un'importante informazione strutturale che mancava nella struttura a raggi X dell'apoproteina precedentemente risolta nel nostro laboratorio. Capitolo 2). Ho eseguito analisi biochimiche e spettroscopiche di FXN umana, da solo e in complesso con ISCU, che mi ha permesso di identificare in FXN i residui coinvolti nel legame di Fe3 + / 2 + e nella sua interazione con ISCU, che è confermato essere dipendente dal ferro . Quindi, poiché molti residui di FXN che ho trovato coinvolti nell'interazione diretta con ISCU sono mutati in pazienti con varianti di FRDA, ho valutato se e come queste mutazioni possono interferire con l'interazione diretta ISCU-FXN e con la sua capacità di legare il ferro. Ho trovato che le varianti di fratassina FRDA-correlate in cui le mutazioni si trovano nella regione di legame ISCU non influenzano le proprietà di legame con ferro di fratassina, mentre compromettono sia l'interazione con ISCU e la capacità di attivare il complesso SDU. Altre varianti di fratassina legate a FRDA, invece, in cui le mutazioni sono localizzate nella regione di legame del ferro o tra quest'ultima e la regione legante ISCU, influenzano, come previsto, la capacità di FXN di legare il ferro senza compromettere completamente la sua interazione con ISCU. Inoltre, queste varianti FXN mantengono una capacità parziale di attivare il complesso SDU. Presi insieme, questi risultati aprono nuove prospettive nello studio dei meccanismi che portano alle varianti FRDA e forniscono ulteriori suggerimenti utili a chiarire il ruolo fisiologico di FXN e il suo contributo alla patogenesi dell'atassia di Friedreich.