Physiopathological characterization of the role of MCUb in skeletal muscle regeneration

Calcium ions play key roles in different intracellular mechanisms, ranging from biological processes such as proliferation, gene transcription, protein post-translational modifications and aerobic metabolism to physiological mechanisms such as muscle contraction, exocytosis, energy metabolism, chemotaxis and synaptic plasticity during learning and memory [1,2]. Key players in the spatio-temporal regulation of cytosolic calcium concentrations ([Ca2+]cyt) are mitochondria, intracellular organelles that can accumulate Ca2+ in the very rapid time-scale of hundreds of milliseconds [3] and reach values up to 100 µM in some cell types [4]. Mitochondrial Ca2+ overload, caused by either abnormal release from internal stores, physical damage of mitochondria or malfunction of receptors and channels present in their membrane, has been long known to be a critical event in the bioenergetic crisis associated with cell death by necrosis [2]. Furthermore, one of the most important roles that highlights the importance of mitochondrial Ca2+ in cell metabolism and survival is the mitochondrial Ca2+-dependent control of mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) production, the main fuel for sustaining diverse cell functions [5,6]. Thus, the understanding of the role of mitochondria in regulating cellular Ca2+ homeostasis has become crucial for the understanding of a series of cell functions. Nevertheless, this analysis was severely limited due to the lack of molecular information on the identity of the protein responsible of mitochondrial Ca2+ uptake. The situation completely reversed in 2011 when Mootha’s and our laboratory identified the molecular identity of the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) [7,8]. From that moment, we have witnessed an explosion of studies aimed to characterize the composition and regulation of the complex. It is now clear that MCU exists in a large protein complex that includes pore-forming and regulatory subunits [9]. The pore forming subunit includes MCU, the MCU dominant-negative subunit, MCUb, and the essential MCU regulator, EMRE, whereas the regulatory subunit includes the mitochondrial calcium uptake protein 1 and 2, MICU1, MICU2 [7,10–13]. One of the most peculiar subunits of the MCU complex is MCUb that was identified in our laboratory in 2013 as one of the components of the pore region of the MCU complex [10]. We have demonstrated that MCUb inhibits mitochondrial Ca2+ uptake by acting as a dominant-negative subunit of MCU [10]. Intriguingly, the ratio of expression between MCU and MCUb varies greatly between tissues (e.g.: 3:1 in heart or lung and 40:1 in skeletal muscle) [10], and this might contribute to the spatiotemporal regulation of mitochondrial Ca2+ uptake. Indeed, the MCU/MCUb ratio correlates with patch clump recording data of mitochondrial Ca2+ uptake of isolated mitochondria from different tissues [14]. Our Real Time-PCR experiments demonstrated that MCUb expression levels dramatically increase during skeletal muscle regeneration 3 days after cardiotoxin (CTX)-induced injury. This induction is specific, since the expression of the other components of the MCU complex is unchanged in this condition. Therefore, we hypothesized that MCUb might play a role in the progression of skeletal muscle regeneration after damage. In addition, high MCUb expression levels have been detected in anti-inflammatory macrophages (M2), one of the most important effectors of the later stages of tissue repair [15–17]. Importantly, our in vitro results demonstrated that MCUb silencing affects macrophages polarization towards an M2 pro-regenerative phenotype and that, during the progression of skeletal muscle regeneration in vivo, MCUb is induced selectively in macrophages. We therefore asked whether MCUb overexpression in M2 macrophages, occurring during skeletal muscle regeneration, could be crucial for their differentiation and thus for tissue repair. To answer to this question, we performed skeletal muscle regeneration experiments on a total MCUb knockout (KO) mouse model. We observed that MCUb ablation in vivo affects macrophage skewing from a pro-inflammatory (M1) to an M2 phenotype. It is widely accepted that M1 and M2 macrophages actively participate to skeletal muscle regeneration process by releasing cytokines and growth factors that promote skeletal muscle regeneration [15]. Specifically, M1 macrophages promote the activation and proliferation of satellite cells, while M2 macrophages are involved in the last stages of skeletal muscle repair by promoting the differentiation and fusion of myogenic precursor cells (MPCs) [15]. We hypothesized that an impairment in M1 to M2 transition might also influence skeletal muscle repair capacity by affecting the expression levels of myogenic regulatory factors. Strikingly, our results demonstrated that the lack of MCUb, by influencing macrophage plasticity and function, might negatively influence the expression of early myogenic regulatory genes Pax7 and Myod, crucial regulators of proliferation and differentiation of satellite cells [18,19], causing an impairment in skeletal muscle regeneration process. Our results strongly support the hypothesis that this altered muscular phenotype is caused by an impairment in macrophages skewing from the M1 to the M2 phenotype, since M2 macrophages are endowed with pro-regenerative capacity [15–17]. This is supported by our latest data showing that macrophages from MCUb KO animals present lower phagocytic capacity compared to wild type animals. These results are in line with published data, demonstrating that the phagocytic activity is fundamental for M2 polarization [20]. Intriguingly, we observed a significant reduction in the number of regenerating myofibers in regenerating muscles of MCUb KO mice compared with WT animals, parameter related to the efficiency of skeletal muscle regenerative capacity. Furthermore, it is well established that, during skeletal muscle regeneration, satellite cells that are not initiated to differentiation, return to quiescence to replenish the reserve population of satellite cells that will become activated during further rounds of muscle injures [21]. In order to evaluate whether MCUb KO mice show an alteration in the reconstitution of the satellite cells pool, we performed a triple skeletal muscle regeneration experiment, as already performed [22]. Intriguingly, we found a dramatic decrease in the cross-sectional area of regenerating muscle fibers in MCUb KO mice compared with WT animals. This result suggests that a possible exhaustion of the pool of satellite cells might occur in the MCUb KO animals by affecting the myogenesis process after damage. We also observed that MCUb KO mice show a decrease in collagen content suggesting that MCUb ablation, by affecting M2 polarization, and thus function, alters the reconstitution of muscle structure. These results are in line with data in literature that demonstrate the role of M2 macrophages in collagen production [16]. Finally, we analysed in detail the mechanism responsible for MCUb induction in M2 macrophages. We found that MCUb promoter, and thus its transcription in macrophages, is activated by IL-4. We thus hypothesized that the IL-4-STAT6 pathway, that is known to be involved in M2 macrophages polarization [23], might also regulate MCUb transcription. In the future, we will analyse also the 5' AMP-activated protein kinase (AMPK) phosphorylation state, the cellular metabolic sensor, that it is known to mediate macrophage skewing from an M1 to M2 phenotype [20]. We believe that MCUb, by regulating the entry of Ca2+ into mitochondria, and thus the rate of ATP production, might induce the activation of this pathway. It is known that perturbations of macrophage function and/or activation may result in impaired regeneration and fibrosis deposition, as described in several pathological disease [15], and that skeletal muscle repair system is compromised during ageing and in patients affected by muscular dystrophies [24]. Therefore, our research might be fundamental for the understanding of the molecular basis of chronic muscular diseases, such as the Duchenne Muscular Dystrophy (DMD).

Il Ca2+ riveste un ruolo fondamentale nella regolazione di un vasto spettro di processi biologici e fisiologici come la proliferazione cellulare, la trascrizione genica, la stimolazione del metabolismo aerobico, la regolazione della contrazione muscolare, l’esocitosi e la plasticità sinaptica [1,2]. I principali organelli intracellulari predisposti alla regolazione della concentrazione di Ca2+ citosolica ([Ca2+]cit) sono i mitocondri. Quest’ultimi hanno la capacità di accumulare molto velocemente elevate [Ca2+][3] che in alcuni tessuti possono raggiungere livelli superiori ai 100 µM [4]. L’alterato rilascio di Ca2+ dalle riserve intracellulari, il danno mitocondriale o il malfunzionamento dei recettori e canali presenti nella loro membrana possono portare ad un accumulo eccessivo di Ca2+ all’interno del mitocondrio, fenomeno che è stato dimostrato condurre ad una crisi energetica con conseguente induzione di morte cellulare [2]. In condizioni fisiologiche, il Ca2+ mitocondriale riveste un ruolo fondamentale nella sopravvivenza e metabolismo cellulare sostenendo la produzione dell’adenosina trifosfato (ATP), la principale molecola energetica della cellula, necessaria per lo svolgimento di diverse funzioni cellulari [5,6]. Di conseguenza, lo studio del ruolo dei mitocondri nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+ è diventato cruciale per la comprensione di una elevata serie di funzioni cellulari. Sfortunatamente, l’analisi di questo aspetto è stata fortemente limitata dalla mancata caratterizzazione molecolare della proteina responsabile dell’accumulo di Ca2+ mitocondriale. Nel 2011, nel nostro laboratorio e in quello del Prof. Mootha è stata scoperta l’identità molecolare dell’uniporto del Ca2+ mitocondriale (MCU), proteina necessaria e sufficiente a permettere l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio [7,8]. Questa scoperta ha permesso l’identificazione di vari componenti dell’uniporto e dei meccanismi che regolano la sua funzione [9]. E’ ormai chiaro che MCU esiste sotto forma di un complesso, costituito da diverse subunità che compongono la regione del poro (MCU, MCUb, EMRE) e da subunità regolatorie (MICU1, MICU2) [7,10–13]. Tra le varie subunità che compongono il complesso, un ruolo rilevante è svolto da MCUb. Questa subunità è stata identificata nel 2013 nel nostro laboratorio come parte integrante della regione formante il poro del canale [10]. Abbiamo dimostrato che MCUb agisce come dominante negativo di MCU in quanto inibisce l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio [10]. Nonostante l’elevata similarità in sequenza e struttura, MCU e MCUb mostrano un diverso grado di espressione nei diversi tessuti (es: rapporto di 3:1 nel cuore e polmone e di 40:1 nel muscolo scheletrico). E’ stato ipotizzato che queste differenze possano contribuire alla regolazione spazio-temporale dell’ingresso di Ca2+ mitocondriale nei diversi tessuti [10]. Coerentemente, il diverso grado di espressione di MCU e MCUb nei vari tessuti correla con dati ottenuti da esperimenti di patch clamp in cui è stato misurato l’accumulo di Ca2+ in mitocondri isolati da diversi tessuti [14]. Esperimenti di Real Time-PCR da noi condotti hanno dimostrato una elevata induzione dell’espressione di MCUb durante il corso della rigenerazione del muscolo scheletrico 3 giorni dopo il danno indotto da cardiotossina (CTX). Questa induzione è specifica in quanto l’espressione delle altre componenti del canale è inalterata in questa condizione. Dal momento che, in condizioni basali, MCUb è poco espresso nel muscolo scheletrico e che la sua espressione aumenta significativamente e specificamente durante il corso della rigenerazione muscolare, abbiamo ipotizzato che MCUb potesse avere un ruolo fondamentale in questo processo. In aggiunta, MCUb è specificatamente espresso in macrofagi con fenotipo anti-infiammatorio (M2), facendo ipotizzare che l’aumento significativo di MCUb, osservato durante il corso della rigenerazione, potesse essere attribuito alla componente macrofagica. Infatti, i macrofagi di tipo M2, che infiltrano massivamente un muscolo rigenerante, partecipano attivamente durante le ultime fasi che caratterizzano questo processo [15–17]. Risultati ottenuti da esperimenti effettuati in vitro hanno dimostrato che il silenziamento di MCUb nei macrofagi impedisce a quest’ultimi di acquisire un fenotipo di tipo M2. Questo dato fa emergere l’ipotesi che MCUb, in vivo, possa rivestire un ruolo fondamentale nella polarizzazione dei macrofagi dal tipo M1 al tipo M2 e in questo modo influire sulla rigenerazione del muscolo scheletrico in seguito a danno. Per confermare le nostre ipotesi, sono stati condotti degli esperimenti di rigenerazione del muscolo scheletrico utilizzando un modello murino in cui MCUb è stato deleto in tutti i tessuti (MCUb knockout (KO)). I nostri risultati dimostrano che la mancanza di MCUb, durante il corso della rigenerazione muscolare, impedisce la polarizzazione dei macrofagi da un fenotipo pro-infiammatorio (M1) a quello anti infiammatorio (M2). E’ ormai ampiamente accettato il concetto che i macrofagi di tipo M1 e M2 influenzino il corso della rigenerazione muscolare attraverso il rilascio di citochine e fattori di crescita che facilitano la risoluzione del danno [15]. In particolare, i macrofagi di tipo M1 promuovono l’attivazione e proliferazione delle cellule satellite mentre gli M2 sono coinvolti negli ultimi stadi della rigenerazione promuovendo il differenziamento e la fusione dei precursori delle cellule muscolari (MPCs ) [15]. Abbiamo quindi ipotizzato che la mancata transizione dei macrofagi dal profilo pro-infiammatorio (M1) a quello anti-infiammatorio (M2) potesse influenzare negativamente l’espressione di geni codificanti fattori di trascrizione coinvolti nelle varie fasi di riparazione del muscolo scheletrico in seguito a trauma. Questa ipotesi sembra confermata. Infatti, l’espressione di Pax7 e di Myod, regolatori cruciali del processo di proliferazione e differenziamento delle cellule satelliti [18,19], appare essere drasticamente ridotta nei topi MCUb KO rispetto ai topi di controllo durante il corso della rigenerazione muscolare, suggerendo un’alterazione del processo di rigenerazione muscolare in mancanza di MCUb. Questi risultati supportano l’ipotesi che l’alterato fenotipo muscolare osservato nei topi KO possa essere ricondotto alla mancata transizione dei macrofagi dal fenotipo di tipo M1 a quello di tipo M2, considerato che quest’ultimi sono dotati di capacità pro-regenerative [15–17]. Ulteriore conferma del fatto che l’assenza di MCUb possa influenzare negativamente la transizione fenotipica dei macrofagi da M1 a M2, deriva dalla dimostrazione che i macrofagi derivanti dal topo MCUb KO, mostrano una riduzione dell’attività fagocitica, funzione essenziale per la polarizzazione dei macrofagi verso un fenotipo di tipo M2 [20]. Un altro parametro attraverso il quale è stato possibile valutare l’efficienza della rigenerazione del muscolo scheletrico, si basa sull’osservazione che il numero di fibre rigeneranti nei topi KO risulta significativamente ridotto rispetto alle fibre dei topi di controllo 14 giorni dopo l’induzione del danno. E’ noto che, durante il corso della rigenerazione muscolare, le cellule satelliti che non vanno incontro al processo di differenziamento, ritornino ad uno stato di quiescenza andando a ricostituire la nicchia di cellule satelliti originarie che verranno attivate in seguito ad ulteriore trauma [21]. Con lo scopo di valutare se i topi MCUb KO mostrino un’alterazione nella ricostituzione della riserva di cellule satelliti in seguito a danno muscolare, abbiamo condotto degli esperimenti di tripla rigenerazione, come precedentemente effettuato [22], e abbiamo osservato una sostanziale riduzione dell’area delle fibre rigeneranti dei topi KO rispetto a quelle dei topi controllo. Da questi risultati è emersa l’ipotesi che l’assenza di MCUb possa impedire la ricostituzione del pool di cellule satellite, alterando, in questo modo, il normale decorso della rigenerazione. In linea con questi dati abbiamo osservato come l’ablazione di MCUb, impedendo la polarizzazione dei macrofagi di tipo M2, influenzi negativamente la quantità di collagene, componente essenziale della matrice extracellulare [16], depositata durante la fase di riparazione muscolare. Questi risultati sono in linea con dati presenti in letteratura che dimostrano il ruolo dei macrofagi di tipo M2 nella produzione di collagene [16]. La dimostrazione che l’espressione di MCUb sia indotta nei macrofagi di tipo M2 ci ha spinti allo studio dei meccanismi che regolano la trascrizione di MCUb in questa sottopopolazione di cellule. In particolare, abbiamo dimostrato come l’IL-4, citochina di tipo anti-infiammatorio, attivi la trascrizione di MCUb. Dal momento che l’ablazione di MCUb nei macrofagi impedisce la loro polarizzazione verso un fenotipo di tipo M2, abbiamo ipotizzato che la via di segnale mediata dall’asse IL-4-STAT6, nota per essere coinvolta nella polarizzazione dei macrofagi M2 [23], possa essere coinvolta nell’attivazione della trascrizione di MCUb. In futuro, analizzeremo lo stato di fosforilazione di AMPK, uno dei principali sensori metabolici cellulari, che è stato dimostrato essere un giocatore essenziale nella transizione dei macrofagi dal fenotipo M1 a quello M2 [20]. La nostra ipotesi è che, MCUb, regolando negativamente l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio e quindi la produzione di ATP, possa indurre l’attivazione di vie di segnale mediate da AMPK influenzando, in questo modo, la polarizzazione dei macrofagi. E’ ormai noto che perturbazioni nella funzionalità e attivazione dei macrofagi possano portare ad alterazioni nel processo rigenerativo e alla deposizione di tessuto fibrotico, come descritto in diverse condizioni patologiche [15]. Questa condizione è una caratteristica comune a diverse patologie come le distrofie muscolari e durante l’invecchiamento [25]. Per questo motivo, la nostra ricerca potrebbe rivelarsi fondamentale per la comprensione delle basi molecolari di malattie croniche del muscolo scheletrico, come la distrofia di Duchenne (DMD) e potrebbe portare all’identificazione di nuovi bersagli ter