Genetic engineering approaches to increase microalgae light use efficiency

In the next fifty years world population will reach 9-10 billion of people. This increment will drastically increase energy and food demand. The current global food and energy supply chain is not sustainable and it causes increasing CO2 emissions, exacerbating the greenhouse effect and the climate change, whose effects we are already experiencing. The Climate Change conference hold in Paris in 2015 showed a global consensus on the need to drastically reduce carbon emissions to avoid the environmental disaster, which is leading to many negative effects like desertification, animal and plants species extinction and ocean acidification. In order to face this challenge different strategies are under study and development. Microalgae are emerging as an interesting possibility for the production of energy and food. Being photosynthetic organisms, algae biomass is produced from CO2 fixation, and contains proteins, and lipids exploitable as food or fuel. Despite their potential, microalgae production on a large scale is still not competitive on the food and energy market. One of the main limitation is that photosynthetic efficiency at the industrial scale is reduced, negatively affecting growth and biomass accumulation. All first attempts of algae large scale cultivation have been pursued cultivating wild type strains (WT) that evolved in an environment extremely different and thus they are not adapted to have a maximal productivity in the industrial system. As done with crops domestication, there is the need to modify genetically strains in order to adapt them to grow in industrial systems and increase productivity. There are different algal species that are emerging as promising candidates for food and fuel production and among them the largest part of this work is focused on Nannochloropsis gaditana, a marine microalga able to accumulate lipids and molecules like β-carotene interesting for nutraceutical purposes. After a general introduction, chapter 2 described the generation of a collection of random mutants of N.gaditana exploiting two different mutagenic approaches, one based on the use of the mutagen compound Ethyl Methane Sulfonate (EMS) and the other one based on random insertion of a resistance cassette to zeocin. The collection was screened for strains altered in the photosynthetic apparatus using a multiple steps in vivo fluorescence analysis. In Appendix 1 I collaborated in evaluation of the productivity for one of these strains (E2) in a fed batch system mimicking an industrial culture. E2 was selected for a reduction in the chlorophyll content and also in the PSII antenna size. One of the limitations in algae mass cultures is that light penetration negatively affects growth and thus a strain with a reduction in the light absorption capacity could have a productivity advantage. This work indeed showed that the strain E2 had increased productivity with respect to WT, but also highlighted the seminal influence of the cultivation parameters on strains performances. Most of the PhD work was then invested on the characterization of two promising insertional strains. The first strain presented in chapter 3 is I29. This is a low chlorophyll (Chl) content mutant with no difference in the antenna size of PSII. In flask culture I29 showed a reduction of 20% in the Chl content respect to the WT, which leaded also to a higher electron transport rate (ETR). The site of insertion of the resistance cassette was identified but there was no apparent effect on transcription level of closest genes. The full genome of the strain was thus re-sequenced revealing a point mutation in a key gene involved in the chlorophyll biosynthetic pathway, a highly likely candidate to justify the phenotype. I29 in lab scale PBR was also assessed evidencing an increase in productivity of 14% with respect to the WT. An analogous work was done in chapter 4 for the characterization of another interesting mutant from the collection isolated in chapter 2, the mutant I48. This mutant has a severe reduction in the non-photochemical quenching (NPQ) activation. The site of insertion was not identifiable because of the presence of tandem insertions and again the strain genome was re-sequenced highlighting the presence of point mutations due to electroporation. Among these we found an interesting one in the gene codifying for the protein LHCX1. This is a stress-related antenna protein which in other species like Phaeodactylum tricornutum has already been recognized as a key component of the fast NPQ response. The loss of the protein accumulation was confirmed by Western Blot. Strain response to different illumination conditions was also evaluated highlighting the ability of the mutant to grow also in high light condition. The last part of the characterization was devoted to productivity evaluation since a depletion of NPQ could be advantageous in an industrial condition of a dense culture, where only the external layer are exposed to intense light. A low NPQ phenotype can avoid undesired energy dissipation in the internal layers. We observed a 24% higher productivity for I48 respect to the WT but, as discussed in Appendix 1 this was dependent from growing conditions. In diatoms NPQ has been associated not only to the high light response but also to the fluctuating light (FL) response, which is a condition easily experienced in outdoor cultivation system. We take advantage from the isolation of this mutant with a severe reduction in NPQ to verify what can be the impact of NPQ in N.gaditana response. In chapter 5 we set up an experiment in which we exposed the cultures to 150 μmol of photons m-2s-1 but in the control sample the light intensity was constant, in FLs it was the result of a combination of a low light exposition with high light flashes given with different frequencies and duration. We found that those FL treatments caused a severe growth reduction in WT but I48 showed no increased sensitivity. The growth reduction was proportional to the flash frequency and stronger with higher flash frequency. An analysis of photosynthetic apparatus functionality evidenced that in FL PSII activity is not affected while PSI is largely inactivated. This suggests that alternatives electron transport around PSI, that are active in avoiding its over-excitation, are not as efficient in N.gaditana as in other organisms. These first 5 chapters highlight the potential of microalgae engineering to find new strains more productive respect to the WT. FL experiment not only adds new knowledge about NPQ role in N.gaditana, but taking in count that FL is a condition easily found if we want to exploits sunlight in industrial system, it can be the starting point to find new gene targets to improve productivity. This work started with an insertional approach that in principle should facilitate identification of the genes responsible of the phenotype. In this case this advantage is impaired by the frequent presence of tandem insertions and accumulation of point mutations during transformation. Alternative strategies are thus more suitable and will be pursued in the future. In chapter 6 we tested the chemical mutagenesis and the screening method set up for N.gaditana with Scenedesmus obliquus to evaluate if the approach could be generally applied to any species of interest. Indeed at least a strain with interesting properties was isolated (SOB17). In this work we also evaluated productivity in a flat panel in continuous mode. Indeed the geometry of a flat panel leads to a better light distribution and homogeneity respect to other system like the bottles. Moreover the continuous mode provides a stable culture continuously producing. This culture showed remarkable stability for more than 30 weeks and SOB17 showed a higher productivity in one of the conditions tested but, as observed for Nannochloropsis gaditana strains also in this case operational conditions were shown to have a fundamental influence on strains performances. In addition to the Appendix 1 described above, other two appendix sections are also included in the thesis. They are the results of two different collaboration in which some of the experimental techniques exploited in this work were applied with different aims. In Appendix II, there is the published work “Genetic Engineering of algae photosynthetic productivity using mathematical models” that describes the development of a mathematical model to evaluate the key factors influencing algae biomass productivity in PBR. The model was shown to be able to predict the effect of genetic modifications on algae performances in an industrial context, thus providing a valuable tool to identify the genotypes with the best advantages for productivity. In Appendix III is reported the collaboration with Prof. Angela Falciatore (Diatom Functional Genomics team, at the UPMC-Paris). A screening procedure similar to those one set up for N.gaditana was adapted to search photosynthetic alterations in a collection of Phaeodactylum tricornutum transgenic lines genetically modified by the RNA interference approach, in order to modulate the expression of transcription factors (TF). Thank to this screening procedure we found some promising correlation between the genetic modulation of a class of TFs and the photosynthetic phenotype of mutants strains isolated. Now this correlation phenotype-TF expression level is under validation by confirming the screening phenotype and evaluating the transcripts level.

Si stima che nei prossimi 50 anni la popolazione mondiale aumenterà fino a raggiungere i 9-10 miliardi di persone. Un incremento di queste proporzioni porterà inevitabilmente ad una maggior richiesta di produzione di cibo ed energia. L’attuale metodo di approvvigionamento di queste risorse non è sostenibile in quanto è la causa principale dell’aumento delle emissioni di CO2 in atmosfera, le quali stanno alimentando il cambiamento climatico. Nella conferenza che si è tenuta a Parigi nel 2015 sul cambiamento climatico è emersa chiaramente la necessità di un cambio di tendenza per poter evitare il collasso ambientale, che sta già portando alla desertificazione di molti terreni un tempo fertili, all’estinzione di massa di specie animali e vegetali e all’acidificazione degli oceani. Per invertire questa tendenza quindi bisogna rivedere il nostro sistema di produzione alimentare ed energetica. Tra le possibilità al vaglio le microalghe stanno emergendo come un interessante candidato sia per la produzione di energia che di cibo. Infatti le microalghe sono organismi fotosintetici che producono biomassa fissando CO2. Molte specie sono ricche di proteine e lipidi utilizzabili come nutrimento o come matrice per la produzione di biodiesel. Tuttavia nonostante le loro potenzialità le microalghe non sono ancora utilizzate su larga scala perché la loro produzione continua ad aver un costo troppo elevato a fronte di produttività insufficienti. Uno dei maggiori limiti è legato al calo di efficienza fotosintetica che si registra nel passaggio in scala industriale, la quale impatta negativamente sulla crescita delle microalghe e quindi sulla produzione di biomassa. Tuttavia bisogna tenere conto che ad ora si stanno coltivando ceppi wild type, che quindi si sono evoluti ed adattati per crescere al meglio in un ambiente naturale estremamente diverso da quello industriale. Perciò come si è fatto con la domesticazione delle piante per uso alimentare, sarà necessario un passaggio di ingegnerizzazione dei ceppi parentali per ottenere dei nuovi ceppi più adatti alle condizioni industriali e quindi più produttivi una volta coltivati su larga scala. Ci sono svariate specie algali al vaglio come candidati per la produzione alimentare ed energetica, ma questo lavoro si focalizza principalmente su Nannochloropsis gaditana. Questa è una microalga marina capace di accumulare sia lipidi sia molecole di interesse per la nutraceutica come il β-carotene. Dopo una introduzione generale, nel capitolo 2 viene descritto l’ottenimento di una collezione di mutanti casuali generati attraverso due diversi approcci di mutagenesi. Il primo è un approccio di mutagenesi chimica, che utilizza come agente mutageno l’etil-metano-sulfonato (EMS) e il secondo è un approccio di mutagenesi inserzionale che sfrutta l’inserimento casuale nel genoma di DNA esogeno che conferisca al ceppo la resistenza per la zeocina. Da questa collezione si sono isolati solo i mutanti alterati nell’apparato fotosintetico utilizzando cicli progressivi di selezione attraverso misure di fluorescenza in vivo. In Appendice 1 è riportata la collaborazione nella valutazione delle produttività di uno dei mutanti ottenuti con EMS (E2), in condizioni di semi continuo che mimano una coltura industriale. E2 è stato selezionato perché presentava un ridotto contenuto di clorofilla abbinato anche ad una riduzione del numero di proteine antenna legate al PSII. Infatti uno dei maggiori problemi su scala industriale è la scarsa penetrazione della luce, dovuta alle densità elevate raggiunte dalle colture, la quale ha un impatto negativo sulla produzione. Un mutante con una ridotta capacità di assorbimento della luce può essere vantaggioso perché migliora la distribuzione della luce nel sistema con un conseguente incremento nella crescita. Questo lavoro infatti dimostra come E2 sia più produttivo del WT, ma sottolinea anche che le condizioni di coltura sono fondamentali per utilizzare al meglio il potenziale del ceppo mutato. La maggior parte di questa tesi è stata poi dedicata alla caratterizzazione di due ceppi promettenti ottenuti per mutagenesi inserzionale. Il primo è I29 ed è presentato nel capitolo 3. Questo mutante è stato selezionato perché presentava un ridotto contenuto di clorofilla anche se il numero di proteine antenna per PSII è analogo al WT. In beuta la coltura di I29 mostra un 20% in meno di clorofilla rispetto al WT, che si accompagna con un trasporto elettronico che si satura ad intensità di luce maggiori (maggiore ETR electron transport rate). Il sito di inserzione della cassetta è stato identificato come singolo, ma sembra non influenzare i livelli di trascrizione dei geni vicini. Il completo ri-sequenziamento del genoma ha evidenziato una mutazione puntiforme in un gene chiave nella biosintesi della clorofilla, che può essere un promettente candidato per giustificare il fenotipo di I29. Di questo mutante si è valuta anche la produttività e si è visto un incremento del 14% rispetto al WT. Un lavoro analogo è stato fatto per il mutante I48, isolato sempre nel capitolo 2. Questo mutante ha una importante riduzione nell’attivazione dei meccanismi di dissipazione dell’eccesso di energia luminosa come calore (NPQ). Non è stato possibile individuare il sito di inserzione a causa della presenza di inserzioni multiple in tandem, perciò anche in questo caso il genoma è stato ri-sequenziato. Il sequenziamento ha evidenziato nuovamente la presenza di mutazioni puntiformi dovute al protocollo di trasformazione. Tra queste è emersa una mutazione nel gene codificante per la proteina LHCX1. Questa è una proteina antenna coinvolta nella risposta allo stress luminoso, il cui ruolo chiave nella risposta rapida del NPQ è già stato evidenziato in altre specie come Phaeodactylum tricornutum. Il mancato accumulo di questa proteina è stato confermato attraverso Western Blot. Si è valutata la capacità di questo ceppo di crescere in diverse condizioni luminose. È emerso che I48 è in grado di crescere anche in alta luce nonostante questa riduzione nella risposta di NPQ. L’ultima parte della caratterizzazione ne ha valutato invece la produttività. Infatti una riduzione nel NPQ può essere vantaggiosa in condizioni industriali in quanto in una coltura densa solo lo strato esterno è esposto a luci intense. Perciò un NPQ ridotto può evitare una dissipazione indesiderata di energia negli strati più interni dove la luce è già limitante. I48 ha mostrato un aumento di produttività del 24% rispetto al WT, ma come già discusso in Appendice 1 questo è strettamente dipendente dalle condizioni di coltura. Nelle diatomee il NPQ è stato associato non solo alla risposta ad alta luce ma anche a quella alla luce fluttuante (FL), una condizione facilmente sperimentabile nei sistemi di coltura all’esterno. Abbiamo sfruttato questo mutante con una marcata riduzione nel NPQ per verificare qual è l’impatto di questi meccanismi nella risposta di N.gaditana alla luce FL. Nel capitolo 5 quindi è stato messo a punto un esperimento in cui le colture sono state esposte ad una intensità luminosa di 150 μmol di fotoni m-2s-1, i quali nel controllo sono somministrati in modo costante, mentre nelle FL sono frutto di una combinazione di una bassa luce di base inframmezzata da flash di alta luce, dati con frequenze e durate diverse. Il risultato è un forte impatto delle FL sulla crescita del WT. Il difetto di crescita è proporzionale alla frequenza dei flash ed è più marcato alle frequenze maggiori. Tuttavia I48 non mostra una sensibilità maggiore a questo genere di trattamento rispetto al WT, perciò il NPQ non sembra essere coinvolto in modo significativo nella risposta di N.gaditana alla luce FL. Approfondite analisi sulla funzionalità dell’apparato fotosintetico hanno evidenziato che l’attività del PSII non è compromessa, bensì è il PSI ad essere pesantemente inattivato. Questo risultato suggerisce che i trasporti alternativi attorno al PSI, che in altri organismi fotosintetici sono attivati per evitare la sovraeccitazione del PSI, non sono così efficienti in N.gaditana. I primi 5 capitoli quindi hanno evidenziato il potenziale dell’ingegnerizzazione delle microalghe per trovare ceppi più produttivi rispetto al WT. Gli esperimento in FL in particolare non solo hanno aiutato a chiarire il ruolo del NPQ in questa microalga, ma tenendo conto che la FL è una condizione facilmente trovabile in sistemi industriali che utilizzano la luce del sole come fonte di energia, può fornire un punto di partenza per trovare nuovi targets di ingegnerizzazione per aumentare la produttività. Inizialmente ci siamo focalizzati su un approccio inserzionale, perché avrebbe dovuto facilitare l’identificazione dei geni responsabili del fenotipo. In questo caso la frequente presenza di inserzioni in tandem e l’accumulo di mutazioni puntiformi ha vanificato questo vantaggio, perciò strategie alternative sono in fase di ottimizzazione per il futuro. Nel capitolo 6 abbiamo invece testato l’approccio di mutagenesi chimica ed il protocollo di selezione, ottimizzati per N.gaditana, su un’altra specie: Scenedesmus obliquus, per valutare se questo metodo può essere applicato con successo a qualsiasi specie di interesse. Almeno un ceppo promettente è stato isolato (SOB17). In questo lavoro si è messo a punto anche un diverso sistema di valutazione delle produttività, attraverso un pannello messo in coltura in continuo. Infatti la geometria del pannello migliora la distribuzione della luce, rendendola più omogenea rispetto ad altri sistemi come la bottiglia. Inoltre la coltura in continuo fornisce una coltura stabile che ha una produzione continua di biomassa. Questa coltura ha avuto una buona stabilità nel tempo, arrivando ad essere, mantenuta per più di 30 settimane e SOB17 ha mostrato anche una maggiore produttività in una delle condizioni testate, anche se di nuovo come si era visto per N.gaditana, le condizioni di coltura sono fondamentali per ottenere il miglior risultato da ogni ceppo. In aggiunta all’Appendice 1 descritta prima, altre due appendici sono incluse nella tesi. Queste sono il risultato di due diverse collaborazioni in cui gli approcci sperimentali messi a punto in questa tesi sono stati applicati con fini diversi. In Appendice 2 è riportato il lavoro già pubblicato “Genetic Engineering of algae photosynthetic productivity using mathematical models” che descrive lo sviluppo di un modello matematico per valutare i fattori che influenzano la produttività delle microalghe nei fotobioreattori. Il modello è in grado di predire gli effetti di modifiche genetiche in un contesto di produzione industriale, fornendo uno strumento per identificare i genotipi più vantaggiosi in termini di produttività. In Appendice 3 è riportata una collaborazione con la Prof.ssa Angela Falciatore (Diatom Functional Genomics team, UPMC-Paris). In questo lavoro è stato adattato il protocollo di selezione ottimizzato per N.gaditana per trovare fenotipi fotosintetici in una collezione di mutanti di Phaeodactylum tricornutum, ottenuti per RNA interference così da modulare l’espressione di diversi fattori di trascrizione. Con questo approccio è stato possibile stabilire alcune promettenti correlazioni tra fenotipo e modulazione di una determinata classe di fattori di trascrizione, che ora saranno validati con un’analisi approfondita del fenotipo di questi mutanti e dei livelli di trascrizione in questi ceppi mutati.