Role of Fusarium graminearum cerato-platanin and hydrophobin proteins in fungal growth and plant infection

Cerato-platanins (CPPs) and hydrophobins (HPs) are small secreted non-catalytic cysteine-rich proteins typical of filamentous fungi. CPPs are possibly localized in the fungal cell walls, they are similar to plant expansins having carbohydrate binding/loosening properties with a non-enzymatic mechanism and can have phytotoxic activity. HPs, after being secreted as monomers from the hyphal apexes, cover the fungal surfaces with a hydrophobic layer and may be involved in several processes such as formation of fungal aerial structures, attachment to hydrophobic surfaces, interaction with the environment and protection against the host defense system by masking the fungal cell wall. The genome of Fusarium graminearum, the causal agent of Fusarium head blight disease (FHB) of wheat and other cereal grains, contains two genes putatively encoding for proteins with a CP domain, named fgcpp1 and fgcpp2, and five genes encoding for HPs, named FgHyd1-5. In order to verify their contribution during plant infection and fungal growth, single and multiple gene knock-out mutants were produced and characterized. Besides, the two F. graminearum CPPs (FgCPPs) were heterologously expressed to investigate their activity. The FgCPPs seem to be dispensable for fungal virulence but protect fungal cell wall polysaccharides from enzymatic degradation. The FgCPPs show a strong ability to reduce, mainly by a non-enzymatic mechanism, the viscosity of carboxymethyl cellulose (CMC), with higher affinity for substrates with medium/high viscosity and favour fungal cellulase activity. The observation that the double knock-out mutant ∆∆fgcpp1,2 grown on CMC produced more cellulase activity than the wild type suggests that the higher enzymatic activity produced by the mutant could compensate during infection for the absence of the FgCPPs activity on plant cellulose. The F. graminearum Hyd2 and Hyd3 are responsible of the hydrophobicity of aerial hyphae and are involved in adhesion of conidia to the host surface during the early stages of the infection process, as shown by the reduced virulence of the ∆hyd2 and ∆hyd3 on Triticum aestivum observed by spray inoculation. Interestingly, triple ∆hyd1,2,3, ∆hyd2,3,4 and ∆hyd2,3,5 mutants produced a reduced number of mature perithecia and showed defects at the cell wall level, being significantly more inhibited than the wild type by β-1,3-glucanase and more susceptible to tebuconazole, an ergosterol biosynthesis inhibitor fungicide. Based on our results, FgCPPs and FgHyds could be used as targets of new molecules in innovative disease management strategies aimed at increasing fungal susceptibility to plant defense proteins or at reducing fungal ability to adhere to host plant tissues. Furthermore, the ability of FgCPPs to loosen CMC and favor cellulase activity could make these proteins suitable for future potential applications in biofuel production using cellulose rich tissues as substrate.

Le cerato-platanine (CPP) e le idrofobine (HP) sono piccole proteine tipiche dei funghi filamentosi non catalitiche, secrete e ricche di cisteina. Le CPP sono probabilmente localizzate nelle pareti delle cellule fungine, sono simili alle espansine delle piante che hanno proprietà di allentamento dei carboidrati con meccanismo non enzimatico e possono avere attività fitotossica. Le HP, dopo essere state secrete come monomeri dagli apici delle ife fungine, coprono le superfici fungine con uno strato idrofobo e possono essere coinvolte in diversi processi come la formazione di strutture aeree fungine, l'attaccamento a superfici idrofobiche, l'interazione con l'ambiente e la protezione contro il sistema di difesa dell’ospite mascherando la parete cellulare dei funghi. Il genoma di Fusarium graminearum, l'agente causale della fusariosi della spiga (Fusarium head blight, FHB) di frumento e altri cereali, contiene due geni codificanti per proteine con un dominio CP, denominati fgcpp1 e fgcpp2, e cinque geni codificanti per HP, denominati FgHyd1 -5. Al fine di verificare il loro contributo durante l'infezione in pianta e la crescita fungina, sono stati prodotti e caratterizzati mutanti knock-out singoli e multipli dei geni in analisi. Inoltre, le due CPP di F. graminearum (FgCPP) sono stati espressi eterologamente per investigare la loro attività. Gli FgCPP sembrano essere superflui per la virulenza del fungo ma proteggono i polisaccaridi delle pareti cellulari fungine dalla degradazione enzimatica. Le FgCPP mostrano una forte capacità di ridurre, principalmente mediante un meccanismo non enzimatico, la viscosità della carbossimetilcellulosa (CMC), con maggiore affinità per substrati con medio/alta viscosità e favorire l'attività della cellulasi fungina. L'osservazione che il doppio mutante knock-out ΔΔfgcpp1,2 cresciuto su CMC ha prodotto più attività cellulasica rispetto al fungo wild type suggerisce che l'attività enzimatica più elevata prodotta dal mutante potrebbe compensare durante l'infezione l'assenza dell'attività delle FgCPP sulla cellulosa vegetale. L’Hyd2 e Hyd3 di F. graminearum sono responsabili dell'idrofobicità delle ife aeree e sono coinvolti nell'adesione dei conidi alla superficie ospite durante le prime fasi del processo di infezione, come dimostrato dalla ridotta virulenza di Δhyd2 e Δhyd3 su Triticum aestivum osservato mediante inoculazione a spruzzo delle spighe. È interessante notare che i tripli mutanti Δhyd1,2,3, Δhyd2,3,4 e Δhyd2,3,5 hanno prodotto un numero ridotto di periteci maturi e hanno mostrato difetti a livello della parete cellulare, essendo significativamente più inibito dalla β-1,3-glucanasi rispetto al fungo wild type e più suscettibili al tebuconazolo, un fungicida inibitore della biosintesi dell'ergosterolo. Sulla base dei nostri risultati, FgCPP e FgHyd potrebbero essere utilizzati come bersagli di nuove molecole in strategie innovative di gestione della malattia volte ad aumentare la suscettibilità fungina alle proteine di difesa delle piante o a ridurre la capacità fungina di aderire ai tessuti delle piante ospiti. Inoltre, la capacità delle FgCPP di allentare la CMC e di favorire l'attività delle cellulasi potrebbe rendere queste proteine idonee per potenziali applicazioni future coinvolte nella produzione di biocarburanti utilizzando come substrato tessuti ricchi in cellulosa.