Suscettibilità ai patogeni di piante transgeniche per produzione di vaccini

Genetic improvement of crop plants is one the main aims of the agriculture in the last decades. The development of recombinant DNA technology has provided an efficient system for introducing new features in cultivated plants, much more powerful than the classical breeding strategies. Besides, this has allowed to consider the genetic transformation of plants as an efficient system for the production of molecules or substances of industrial, medical or chemical interest. Bio-pharming has had a remarkable development over the last years, especially in the human and veterinarian pharmaceutical field. On the basis of such developments some questions have arisen: particularly, given the consistent number of transformed plant lines and the opportunity to grow these plants in the field, little is known about their fitness once cultivated under biotic and non-biotic stress. The aim of this project was to transform Arabidopsis thaliana (Columbia ecotype) by means of a therapeutic gene coding for a hemagglutinin protein HA from subtype H5N1 of an avian influenza virus. The transformation was mediated through Agrobacterium tumefaciens, therefore the insertion was stable in the plant genome. We used the Gateway System (Invitrogen), based on a binary vector system where the fragment is transferred using syte-specific recombination. The destination vector was electroporated into Agrobacterium tumefaciens, which was used to infect Arabidopsis thaliana by floral dipping procedure. The seeds collected from the transformed plants were detected by placing them onto a selective solid medium, and the presence of the HA gene was confirmed by specific PCR analysis. The HA and reference gene expression level was compared by using Real Time analysis. The HA protein presence in the transformed plants was evaluated by SDS-PAGE and western blot analysis using polyclonal antibody. Two transformed lines of plants were experimentally infected with two Arabidopsis thaliana pathogens, Turnip Vein-Clearing Virus (TVCV) and Botrytis cinerea. To test the susceptibility of the transformed plants to these pathogens, different parameters were evaluated: i.e. systemic and local spread of infection, expression level of the resitance gene (PDF1.2, jasmonate pathway, PR1, salicylic acid pathway). In TVCV infections, the virus presence was higher in the transformed lines than in the wild type ones both in the rosette and cauline leaves. This difference is mainly observed in the rosette leaves during the first phases of infection (3rd and 4th DPI), but becomes more evident in the cauline leaves at 5th and 6th DPI. Wild type line showed that viral infection is more rapid in the cauline leaves than in the rosette ones, while the transgenic line revealed more rapid spread of infection in the rosette leaves than in cauline leaves. In the Botrytis cinerea infection the size of necrosis on the leaves of transformed plants was smaller than in the leaves of wild type plants, indicating a higher susceptibility of the transformed plants if compared with the wild type plants. The results obtained confirmed the findings of previous studies indicating that jasmonate pathway is strongly activated after infection with Botrytis cinerea (Thomma et al. 1998). In conclusion, the transgenic plants showed higher susceptibility to these pathogens than the wild type line probably due to the higher metabolic cost to express the exogenous protein that subtracts resources to other activities like the mechanism of the defence response.

Ottenere varietà più produttive e resistenti è sempre stato uno degli obiettivi principali del settore agrario. Nelle ultime decadi, lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante, ha permesso di trasformare geneticamente le piante coltivate al fine di inserirvi caratteristiche nuove e specifiche, non conferibili con i metodi classici di miglioramento genetico. Grazie a queste tecniche, le piante possono essere utilizzate anche per produrre molecole o sostanze di interesse industriale, medico o chimico. L’utilizzo delle piante come bioreattori ha infatti avuto notevole sviluppo negli ultimi anni, soprattutto in ambito farmaceutico, sia medico che veterinario. Nell’ottica di utilizzare queste piante in coltura è necessario valutare oltre ai parametri produttivi, e in particolare la resa e la concentrazione della molecola di interesse nei tessuti della pianta, anche la loro risposta agli stress biotici e abiotici. Lo scopo di questo progetto di dottorato è stato quello di valutare la suscettibilità ai patogeni della pianta modello Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia, geneticamente trasformata con un gene esogeno di interesse farmaceutico, il gene HA del virus influenzale aviario H5N1, codificante una emoagglutinina. La trasformazione è stata effettuata mediante Agrobacteruim tumefaciens, introducendo in modo stabile il gene esogeno nel genoma della pianta, tramite il Gateway System della ditta Invitrogen utilizzando un sistema binario di vettori plasmidici in cui il trasferimento del frammento avviene per ricombinazione sito-specifica. Con il vettore di espressione così ottenuto si è trasformato Agrobacterium tumefaciens, con il quale è stata effettuata l’infezione dei boccioli fiorali tramite la procedura del Floral dipping. La successiva selezione dei semi trasformati ha consentito di individuare alcune linee transgeniche esprimenti in modo costitutivo, la proteina HA. L’inserimento nelle linee selezionate del costrutto genico è stata evidenziata tramite analisi PCR, utilizzando una coppia di primer specifici, mentre la presenza della proteina è stata verificata tramite analisi SDS-PAGE e Western Blot, utilizzando un anticorpo policlonale. Una ulteriore analisi per valutare il livello di espressione della proteina HA è stata effettuata mediante analisi Real Time. Le piante non mostravano alcuna apparente alterazione della crescita e dello sviluppo. Due linee trasformate esprimenti la proteina esogena in maggior quantità sono state infettate sperimentalmente con due patogeni vegetali, il virus Turnip Vein-Clearing Virus (TVCV) e il fungo necrotrofo Botrytis cinerea, entrambi in grado di infettare A. thaliana. Per determinare il livello di suscettibilità al virus delle linee transgeniche è stata valutata la propagazione dell’infezione a livello locale e sistemico. Per stabilire la suscettibilità a B.cinerea sono state considerate le diminuzioni delle lesioni e il grado di espressione di alcuni geni marker coinvolti nei processi di difesa della pianta (gene PDF1.2, patway del jasmonato e PR1, patway del salicilato). Nelle infezioni con il TVCV è stata osservata una maggiore presenza di virus nella linea trasformata rispetto alla linea WT sia a carico delle foglie della rosetta che di quelle apicali. Questa differenza inizialmente (3°- 4° DPI, Days Post Infection) è più evidente a livello delle foglie basali, mentre successivamente in corrispondenza del 5° e 6° DPI diventa molto più marcata nelle foglie apicali. Complessivamente la linea WT evidenzia che l’infezione virale è più rapida nelle foglie del caule che in quelle della rosetta, mentre la linea trasformata mostra un decorso inverso, più rapido nelle foglie della rosetta che in quelle apicali. Nel caso dell’infezione con B. cinerea le linee transgeniche mostrano una maggiore suscettibilità all’attacco del patogeno i quanto la media delle lesioni fogliari è stata circa tre volte maggiore di quella riscontrata nella linea WT, nonché un decorso dell’infezione più veloce. L’analisi dell’espressione di due geni coinvolti nella resistenza, ha confermato precedenti evidenze sulla base delle quali il pathway dipendente da jasmonato è maggiormente coinvolto nelle infezioni di funghi necrotrofi (Thomma et al. 1998). Le piante transgeniche sembrano quindi mostrare una maggior suscettibilità all’infezione con questi patogeni, forse giustificato dallo stress metabolico necessario per la produzione di grandi quantità di proteina esogena, che sottrae risorse per altre attività quali quelle connesse ai processi difensivi.