Edophytes Watching: combining molecular and microscopy approches to isolate, identify, tag, and monitor fungi and bacteria inside plants

This work aims at investigating plant-endophyte interactions under many different standpoints. We took into consideration bacterial as well as fungal microorganisms. Regarding the fungi, endophytic species occurring in orchid plants either as possible mycorrhizal partner as well as other internal colonizers were studied. We analyzed three different species of wild orchids found in the Euganean Hills area, North-Eastern Italy, namely Orchis militaris, Spiranthes spiralis and Orchis purpurea, which are mostly regarded as species in endangered status and for which little is known on the nature and presence of symbionts. An approach involving both molecular methods and microscopy techniques was used. Fungal isolation was performed from surface sterilized roots to obtain pure mycelia. A molecular approach allowed us to amplify the Internal transcribed spacer (ITS) region, starting both from root portions of the orchid plants and from pure cultured mycelia. This genetic region varies relatively little within species but dramatically between species and is easy to amplify because of its high copy number. In addition relatively few primers sets are needed due to the highly conserved SSU and LSU flanking regions. Different amplicons were obtained and analyzed from each species, at first upon their different ARDRA profiles obtained by enzymatic digestions. Representative cases were sequenced and results were examined by BLAST. Fungi of mycorrhizal nature and an additional series of endophytic ones, which are an important component of fungal biodiversity, were found. With different microscopy approaches (Fluorescence, Confocal and Transmission Electron Microscopy) we localized fungi within plant tissues and investigated their features. The hyphal septa found in Orchis militaris and Spiranthes spiralis samples were of basidiomycete type, which was confirmed by the results obtained from DNA extraction, ITS amplification and sequencing. In parallel bacterial endophytes were considered, starting from a previous work in which the coexistence of rhizobia with diverse, endophytic bacterial taxa within nodules of wild legume plants had been demonstrated, using molecular and microscopy-based approaches. In this work in order to co-localize the relevant endophytes inside plant tissues, different fluorescent proteins were used as markers for the different kinds of bacteria. Bacterial strains tagged with GFP were obtained using the pUTgfr2X plasmid, a delivery system for a mini-Tn5 trasposon, expressing kanamycin resistance and the GFP protein. While to obtain bacteria tagged with the rfp gene, a replacement of the gfp with a rfp gene was made starting from plasmid pRL765gfp, obtaining pRL765rfp. Both pRL765rfp and pUT gfp2X vectors were used to incorporate the GFP or RFP cassettes into the chromosome of R. leguminosarum bv. trifolii. In both cases plasmids were introduced by biparental mating. Pseudomonas sp. Hs1::gfp from a wild type Pseudomonas sp. isolated from wild legume nodules was obtained introducing pUTgfp2X by biparental mating. In parallel, to tag an Enterobacter agglomerans also isolated from legumes, pRL765rfp was introduced by electroporation. The four bacterial strains constructed were used to inoculate seedlings of Trifolium repens in nodulation tests. Tagged bacteria were localized on the surface and within plant tissues using Confocal microscopy. Subsequently Pseudomonas sp. Hs1::gfp and Enterobacter agglomerans pRL765rfp were used as co-inoculant strains during nodulation tests performed with seeds of wild legume plants from Sardinia. Their ability to be true endophytes was investigated using jointly standard colony isolation methods and direct PCR amplification of prokaryotic DNA from nodules and other tissues. We found that Pseudomonas sp. Hs1::gfp, upon root inoculation was able to invade one of the wild species of legumes (Tetragonolobus purpureus) and be traslocated to its aerial portions.

Questo lavoro ha come obbiettivo, lo studio con diversi approcci delle interazioni tra piante ed endofiti, sono perciò stati esaminati sia microrganismi batterici che fungini. Per quanto riguarda i microrganismi fungini, sono state studiate le specie endofitiche riscontrabili in piante di orchidea, sia come possibili partner micorrizici che come generici colonizzatori interni. Abbiamo analizzato tre diverse specie di orchidee selvatiche, considerate in pericolo, ritrovate nell’area dei Colli Euganei (Orchis militaris, Spiranthes spiralis e Orchis purpurea) per le quali poco si conosce riguardo alla presenza ed alla natura dei simbionti. Per questo studio è stato scelto un approccio che prevedeva l’utilizzo sia di metodologie molecolari che di tecniche di microscopia; inoltre per ottenere miceli fungini in coltura pura si è provveduto a isolarli dalle radici delle piante sterilizzate in superficie. L’approccio molecolare ci ha permesso di amplificare la regione ITS, partendo sia da miceli in coltura pura che direttamente da porzioni di radici. La regione ITS è una regione facilmente amplificabile con un numero relativamente esiguo di primers, per il suo alto numero di copie e per l’alta conservazione delle regioni che la fiancheggiano. Ulteriormente questa regione ci permette di ottenere interessanti informazioni, in quanto varia relativamente poco all’interno delle specie, ma molto tra specie diverse. Per ogni specie di orchidea analizzata sono stati ottenuti diversi ampliconi, che sono stati differenziati in base ai lori diversi profili ARDRA in seguito a digestione enzimatica. I casi più rappresentativi sono stati sequenziati e i risultati sono stati analizzati su piattaforma BLAST. Mediante analisi di omologie di sequenze sono stati identificati alcuni funghi di natura micorrizica e una serie di altri funghi endofitici, che risultano essere una componente importante della biodiversità fungina all’interno dei tessuti delle piante. Diversi tipi di microscopia: a fluorescenza, confocale ed elettronica a trasmissione sono stati usati per localizzare gli stessi funghi all’interno dei tessuti e analizzarne le caratteristiche. I setti (dolipori) ritrovati nelle ife fungine all’ interno dei campioni di Orchis militaris Spiranthes spiralis erano caratteristici dei basidiomiceti. Queste osservazioni hanno perciò permesso di confermare i risultai ottenuti dalle indagini molecolari. Partendo da un precedente lavoro nel quale è stata dimostrata la coesistenza di rizobi e altri batteri endofitici all’interno di noduli di leguminose selvatiche, per questo progetto si sono considerati anche gli endofiti di tipo batterico. In particolare per localizzare gli endofiti all’interno dei tessuti delle piante si è deciso di utilizzare dei marker fluorescenti diversi per tipi differenti di batteri endofitici e rhizobi. In alcuni ceppi batterici è stato inserito il gene codificante la proteina GFP usando un plasmide pUTgfr2X. Questo sistema trasporta un mini trasposone-Tn5, che esprime oltre alla proteina fluorescente anche la resistenza alla kanamicina. Per ottenere i ceppi marcati con RFP si è dovuto manipolare il plasmide pRL765gfp sostituendo il gene codificante la GFP con quello per la RFP, ricavando così un nuovo plasmide chiamato pRL765rfp. Per quanto riguarda i rizobi sia pRL765rfp che pUTgfp2X sono stati introdotti per coniugazione in R. leguminosarum bv. trifolii, così che i geni codificanti le proteine fluorescenti si integrassero nel cromosoma. Considerando invece le specie endofitiche diverse dai rizobi, un ceppo di Pseudomonas sp. Hs1::gfp è stato ottenuto introducendo per coniugazione in Pseudomonas sp. wt il plasmide pUTgfp2X. Pseudomonas sp. wt era stato precedentemente isolato da noduli di leguminose selvatiche così come Enterobacter agglomerans. Quest’ultimo ceppo (Enterobacter agglomerans) è stato marcato con la RFP introducendo il plasmide pRL765rfp per elettroporazione. I quattro ceppi batterici ottenuti sono stati utilizzati per inoculare piantine di Trifolium repens nei test di nodulazione, utilizzando il microscopio confocale è stato possibile localizzare i batteri sulla superficie delle radici o all’interno delle stesse Successivamente gli stessi endofiti marcati, utilizzati nei test di nodulazione su T. repens (Pseudomonas sp. Hs1::gfp e Enterobacter agglomerans pRL765rfp), sono stati co-inoculati in plantule di leguminose selvatiche della Sardegna per investigare la loro abilità di essere dei veri endofiti. Per questa ultima parte del lavoro si sono utilizzate comuni tecniche di isolamento e amplificazione del DNA dei procarioti tramite PCR. Pseudomonas sp. Hs1::gfp in particolare è in grado di colonizzare una delle specie analizzate (Tetragonolobus purpureus) e di essere traslocato nelle parti aeree.