A PATHOGENIC ROLE FOR MITOCHONDRIA IN COLLAGEN VI MUSCULAR DYSTROPHIES

Mitochondria are essential organelles not only in the life of the cell, but also during death. Indeed, they play a key role in the conservation of energy (in the form of ATP) and in the signaling pathways that lead cells to die. Cell death is regulated by many mechanisms in a wide variety of conditions. One of the most important events in this pathway is the permeability transition, a sudden increase of the inner mitochondrial membrane permeability to solutes with molecular mass below 1500 Da. The entity responsible for this phenomenon is the permeability transition pore (PTP), a high conductance inner membrane channel. Opening of this pore causes several effects such as depolarization, osmotic swelling, cristae remodeling that may result in the rupture of the outer membrane, and eventually in the release of apoptogenic proteins, usually locked up in the mitochondria. The PTP is widely believed to be involved in the pathogenesis of several diseases, and a striking example is represented by CollagenVI-related disorders. Ullrich congenital muscular dystrophy (UCMD) and Bethlem myopathy (BM) are inherited muscle diseases caused by mutations of genes encoding the extracellular matrix protein Collagen (Col) VI. Studies on the mouse model of these disorders (Col6a1-/-) and on patients have shown an increased rate of spontaneous apoptosis, ultrastructural alterations in mitochondria and sarcoplasmic reticulum, and a latent mitochondrial dysfunction with abnormal opening of the PTP in skeletal muscle. Moreover, treatment with Cyclosporin (Cs) A, an immunosuppressive drug used against transplant rejection that desensitizes the PTP by binding to Cyclophilin (CyP)-D, rescues myofibers alterations both in Col6a1-/- mice and in UCMD patients. It should be noted, however, that CsA binds to, and inhibits, all members of the family of CyPs (16 different proteins), which play important roles in pathophysiology. Thus, despite the therapeutic efficacy of this drug in ColVI myopathies, it is impossible to sort the consequences of CyP-D inhibition from those caused by inhibition of other CyPs. Furthermore, CsA also inhibits calcineurin, which has been shown to affect skeletal muscle physiology and mitochondrial shape through the involvement of the pro-fission dynamin related protein-1 (Drp-1). The first aim of the work presented in this Thesis was to clarify whether the beneficial effect of CsA in ColVI dystrophies depends uniquely on PTP desensitization through its inhibition of CyP-D, or on the action of this drug on additional targets. We have crossed Col6a1-/- and Ppif-/- mice (Ppif is the gene coding for CyP-D) to obtain a Col6a1-/-Ppif-/- strain where both genes have been inactivated; and we have studied the phenotype of these animals to determine whether the absence of CyP-D caused a rescue from the disease phenotype. Col6a1-/-Ppif-/- mice show negligible myofiber degeneration, rescue from mitochondrial dysfunction and ultrastructural defects, and normalized incidence of apoptosis. These findings (i) demonstrate that lack of CyP-D is equivalent to its inhibition with CsA at curing the mouse dystrophic phenotype; (ii) establish a cause-effect relationship between CyP-D-dependent PTP regulation and pathogenesis of the ColVI-related disorders; and (iii) validate CyP-D and the PTP as pharmacological targets for the therapy of human ColVI myopathies. The second aim of the work was to establish whether the remarkable therapeutic effects of CsA are also observed with the Cs derivative Debio 025 (D-MethylAlanine3-EthylValine4-cyclosporin), which maintains the ability to bind to, and inhibit, CyPs but does not inhibit calcineurin. We therefore studied NF-AT translocation, T cell activation, propensity to open of the PTP in mitochondria and skeletal muscle fibers, muscle ultrastructure and apoptotic rates in Col6a1-/- mice before and after treatment with Debio 025. The key results we have obtained are: (i) Debio 025 does not inhibit calcineurin, yet it desensitizes the PTP in vivo; (ii) treatment with Debio 025 prevents mitochondrial dysfunction and normalizes the apoptotic rates and ultrastructural lesions of myopathic Col6a1-/- mice. Thus, desensitization of the PTP can be achieved by selective inhibition of CyP-D without inhibition of calcineurin, resulting in an effective therapy of myopathic mice. These findings prove that ColVI dystrophies can be treated with Debio 025; and represent an essential step toward a therapy of UCMD and BM because Debio 025 does not expose patients to the potential harmful effects of immunosuppression. A third question is whether the anomalous depolarizing response to oligomycin, which we have observed in cells from all patients affected by ColVI-related disorders, is a distinctive feature of these diseases, a point that has been questioned in a recent publication. We have studied the mitochondrial response in primary cell cultures derived from muscle biopsies of UCMD and BM patients to different stimuli according to the number of cell passages. Our results indicate that mitochondrial dysfunction is lost after 7 passages in culture, a time when cells also acquire a remarkable resistance to several apoptogenic treatments. These data are compatible with the selection of apoptosis-resistant cells that are presumably present in low numbers in the starting population. Thus, mitochondrial dysfunction, and in general the presence of a pathological phenotype, should be assessed early, and the number of passages is a critical factor to consider when results from different patients, and possibly different pathologies, are compared.

I mitocondri sono organelli essenziali nella vita e nella morte delle cellule. Giocano, infatti, un ruolo chiave sia nella conservazione dell’energia (sottoforma di ATP), che nelle vie di segnale che causano la morte della cellula. La morte cellulare è un processo regolato da molteplici meccanismi ed eventi, tra cui uno dei più importanti è la transizione di permeabilità, ovvero l’aumento improvviso della permeabilità della membrana mitocondriale interna a soluti con massa inferiore a circa 1500 Da. Questo fenomeno è causato dall’apertura di un canale ad alta conduttanza presente nella membrana interna, il poro di transizione di permeabilità (PTP). L’apertura del PTP provoca, nei mitocondri, una serie di effetti a catena, come la depolarizzazione, il rigonfiamento osmotico e il rimodellamento delle cristae, che termina con la rottura della membrana mitocondriale esterna e il conseguente rilascio di proteine pro-apoptotiche nel citoplasma. Il PTP, negli ultimi anni, ha acquisito un ruolo sempre più importante nella patogenesi di diverse malattie, tra cui un esempio interessante è rappresentato dalle distrofie muscolari da deficit di collagene VI. La distrofia muscolare congenita di Ullrich (UCMD) e la miopatia di Bethlem (BM) sono due patologie ereditarie causate da mutazioni nei geni che codificano per il collagene VI, un’importante proteina della matrice extracellulare. Studi condotti sul modello murino per queste patologie (il topo Col6a1-/-) e su pazienti affetti da UCMD, hanno evidenziato, a livello dei muscoli scheletrici, un aumento dell’apoptosi spontanea, di alterazioni ultrastrutturali dei mitocondri e del reticolo sarcoplasmatico e la presenza di una disfunzione mitocondriale latente con anormale apertura del PTP. Inoltre, è stato dimostrato che il trattamento con ciclosporina (Cs) A, un farmaco immunosoppressore usato nella terapia antirigetto per i trapianti che desensibilizza il PTP attraverso il legame con la ciclofilina (CiP)-D, causa il recupero delle alterazioni muscolari sia nei topi Col6a1-/- che nei pazienti. E’, però, importante sottolineare che la CsA lega e inibisce non solo la CiP-D, ma anche gli altri membri della famiglia delle ciclofiline (16 proteine diverse), i quali sono coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Non è, perciò, possibile separare gli effetti causati dall’inibizione della CiP-D da quelli sulle altre ciclofiline. Inoltre, la CsA inibisce anche la calcineurina, una fosfatasi coinvolta nei meccanismi che influenzano la crescita e lo sviluppo del muscolo scheletrico e la morfologia dei mitocondri, quest’ultima attraverso l’azione su una proteina (dynamin related protein-1) importante per la fissione mitocondriale. Il primo obiettivo del lavoro presentato in questa tesi è stato quello di chiarire se gli effetti terapeutici della CsA, riscontrati nelle distrofie muscolari da deficit di collagene VI, dipendessero unicamente dalla desensibilizzazione del PTP attraverso il legame con la CiP-D, oppure se fossero dovuti all’azione di questo farmaco su altri bersagli cellulari. A questo proposito, topi Col6a1-/- sono stati incrociati con topi Ppif-/- (Ppif è il gene che codifica per la CiP-D) in modo da ottenere topi Col6a1-/-Ppif-/- con entrambi i geni inattivati. I topi Col6a1-/-Ppif-/- sono stati studiati per valutare se l’assenza di Cip-D causasse il recupero del fenotipo patologico. Questi animali non presentavano degenerazione a livello delle fibre muscolari, né disfunzioni mitocondriali o difetti ultrastrutturali, e i livelli di apoptosi erano normali. Si è giunti, perciò, ad alcune conclusioni: (i) la mancanza di CiP-D equivale alla sua inibizione da parte della CsA nella cura del fenotipo distrofico murino, (ii) esiste una relazione causa-effetto tra la regolazione del PTP da parte della CiP-D e la patogenesi delle distrofie muscolari da deficit di collagene VI, e (iii) la CiP-D e il PTP possono essere considerati validi bersagli farmacologici per la terapia di queste distrofie. Il secondo obiettivo del lavoro è stato quello di valutare gli effetti terapeutici su topi Col6a1-/-di un derivato della CsA, la D-metilalanina3-etilvalina4-ciclosporina o Debio 025, il quale mantiene la proprietà di inibire le ciclofiline, ma non la calcineurina. Abbiamo, quindi, studiato, la traslocazione calcineurina-dipendente di NF-AT, l’attivazione dei linfociti T, la probabilità di apertura del PTP in mitocondri isolati e fibre muscolari, ultrastruttura e grado di apoptosi spontanea a livello dei muscoli scheletrici, prima e dopo la somministrazione, a topi Col6a1-/-, di Debio 025. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il trattamento con Debio 025: (i) non inibisce la calcineurina, ma ha potere desensibilizzante sul PTP; (ii) previene la disfunzione mitocondriale, normalizza i livelli di apoptosi spontanea e i difetti ultrastrutturali dei topi distrofici. Quindi, la desensibilizzazione del PTP può essere ottenuta grazie all’inibizione della Cip-D senza l’azione sulla calcineurina. Questi dati sono la prova che il Debio 025 ha effetti terapeutici sul modello animale per le distrofie da deficit di collagene VI e rappresentano, inoltre, un importante passo avanti verso una possibile terapia a lungo termine per i pazienti affetti da UCMD o BM, dato che il Debio 025 è privo di effetti immunosoppressori. Una terza questione analizzata è stata, infine, se l’anomala depolarizzazione mitocondriale presente nelle cellule di pazienti affetti da deficit di collagene VI fosse una caratteristica distintiva di queste patologie, argomento dibattuto in una recente pubblicazione. Abbiamo, perciò, studiato la risposta mitocondriale nelle colture cellulari primarie ottenute da biopsie muscolari di pazienti UCMD e BM, in risposta a diversi stimoli e in funzione del numero di passaggi in coltura. I nostri risultati indicano che la disfunzione mitocondriale viene persa dopo 7 passaggi in coltura e che, dopo questo tempo, le cellule risultano meno sensibili a diversi stimoli apoptotici. Questi dati sono compatibili con una selezione delle cellule resistenti all’apoptosi, che probabilmente erano già presenti fin dall’inizio in coltura, ma in numero limitato. Quindi, la disfunzione mitocondriale, e in generale la presenza di un fenotipo patologico, dovrebbero essere analizzati in colture giovani; infine, il numero di passaggi è un fattore critico da considerare quando vengono paragonati studi su diversi pazienti e su diverse patologie.