Microarray Analysis: a Leading Tool in the Classification and Biological Characterization of Pediatric Onco-Hematological Diseases

Gene Expression Profile (GEP) analysis through microarrays represents a powerful tool for the classification, the prediction and the identification of several leukemia subclasses. In this thesis, we have reported the results we have obtained applying the microarray technology to the study of pediatric onco-hematological diseases. A huge amount of reports have highlighted the robustness of GEP in the classification of leukemia in both children and adults and these results support the application of microarrays in future routine diagnostic settings. Since the quality of RNA used for the experiments is one of the critical factors when performing microarrays analysis and seeing that all laboratories commonly use their own distinctive RNA isolation protocol, we have questioned the influence of the three most frequently used extraction protocols in the gene expression profile analysis of pediatric leukemia. Our data have showed that different sample preparation procedures do not impair samples classification and that the underlying biological characteristics of the pediatric acute leukemia classes largely exceed the variations between different RNA preparation protocols. We have then applied GEP analysis to the study of MLL/AF4-rearranged B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). Among the MLL/AF4 BCPs leukemia samples, we have identified the presence of two subgroups of patients characterized by a distinctive gene expression signature in which the down-regulation of the HOXA genes is a particularly outstanding factor. HOXA genes deregulation, indeed, is commonly believed to be a key mechanism of MLL-fusion gene mediated leukemogenesis. Apart from the differential HOXA genes expression level in these subgroups of patients, no transcriptional deregulation of other known MLL-related genes (i.e. MENIN, HOXC8 and MEIS1) could be identified. We have also performed a microRNA expression profile analysis of the patients characterized by the up- or down-regulation of HOXA genes and we have demonstrated that they are characterized also by a distinct microRNA signature. Interestingly, patients displaying a low expression value of HOXA genes do not express the miR-196b which is located within the HOXA cluster and which is involved in leukemogenesis. Furthermore, we have used microarray analysis to study Juvenile Myelomonocytic Leukemia (JMML). Remarkably, we could distinguish two distinct subgroups among the analyzed patients and this subdivision resulted to have a high prognostic value in the identification of subgroups of patients with distinct clinical outcome. The same result is not reproducible if the usual clinical factors (fetal Hb, age at diagnosis and platelet count) are applied. Finally, we have focused on the role of the suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS-2). This gene is reported to be up-regulated in stem cells and we have identified SOCS-2 as one of the most up-regulated genes in MLL/AF4 patients irrespective of HOXA gene expression level, when comparing t(4;11) samples with normal bone marrow controls. Transient silencing of SOCS-2 in the lymphoid cell line RS4;11 showed that SOCS-2 depletion induces apoptosis in silenced cells and that this process is characterized by the concurrent increased expression of TP53 and BAX. Thus, SOCS-2 up-regulation seems to be a mechanism in RS4;11 cells to impair apoptosis activation. We have analyzed SOCS-2 expression levels in patients belonging to several different ALL subclasses and have found that SOCS-2 is up-regulated in all but T-lineage leukemia. This finding suggests that SOCS-2 up-regulation could be a common mechanism in ALLs to prevent induction of apoptosis.

L’analisi del profilo d’espressione genica mediante microarray rappresenta uno strumento utile per la classificazione delle leucemie in ambito diagnostico, l’identificazione di nuove sottoclassi di malattia e l’associazione di profili d’espressione genica con la prognosi. I molteplici lavori pubblicati nell’ambito delle malattie onco-ematologiche sia nell’adulto che nel bambino hanno evidenziato la robustezza della tecnologia microarray ed auspicano, quindi, l’ utilizzo dei microarrays in affiancamento alle metodiche “gold standard” per la diagnosi di leucemia. Considerando che la qualità dell’RNA di partenza è un fattore determinante per la buona riuscita di un esperimento di studio dell’espressione genica, abbiamo valutato se diverse metodiche di isolamento dell’RNA avessero una qualche influenza sulla variazione del profilo d’espressione genica. I risultati ottenuti nel nostro studio, analizzando diversi sottotipi di leucemie pediatriche, hanno evidenziato che le metodiche impiegate per l’estrazione dell’RNA non vanno ad influire sul profilo d’espressione genico e che quest’ultimo rimane, comunque, ben identificabile a prescindere dalla metodologia usata per l’isolamento dell’RNA. Applicando, poi, l’analisi microarrays alle leucemie a cellule precursori B e con traslocazione MLL/AF4, abbiamo individuato, all’interno di questo sottotipo di leucemia ritenuto fino ad ora omogeneo, due sottogruppi di pazienti caratterizzati da un differente profilo d’espressione genica in cui spiccava la diversa espressione dei geni HOXA. Questo risultato è alquanto sorprendente poiché la maggiore espressione dei geni HOXA è una caratteristica distintiva delle leucemie con riarrangiamento del gene MLL. Non abbiamo identificato nessuna altra variazione d’espressione di geni (per es. MENIN, HOXC8 e MEIS1) comunemente associati con le leucemie con riarrangiamento del gene MLL. Anche l’analisi del profilo dell’espressione dei microRNA ha dimostrato che questi pazienti possono essere suddivisi in due sottogruppi ben distinti ed, inoltre, ha evidenziato che i pazienti con bassa espressione dei geni HOXA non esprimono il microRNA mir-196b, che è localizzato nel medesimo cluster dei geni HOXA e che è coinvolto nei processi di leucemogenesi. Lo studio del profilo d’espressione genica di pazienti affetti da leucemia mielomonocitica giovanile (JMML) ci ha, poi, consentito di dividere i campioni analizzati in due sottogruppi. Questa suddivisione è associata, in modo altamente significativo, con la prognosi di malattia. Il medesimo risultato prognostico non è conseguibile prendendo in considerazione i fattori prognostici clinici standard (emoglobina fetale, età alla diagnosi e conta piastrinica). Infine, abbiamo studiato il ruolo del gene SOCS-2 nelle leucemie con riarrangiamento MLL/AF4. Questo gene, up-regolato nelle cellule staminali, è uno dei geni maggiormente espressi nei pazienti con MLL/AF4 rispetto ai controlli normali. Il silenziamento di SOCS-2 nelle cellule RS4;11 determina un aumento dell’apoptosi rispetto alle cellule silenziate con un siRNA di controllo ed una simultanea maggiore espressione di TP53 e BAX. L’over-espressione di SOCS-2 nelle cellule RS4;11 sembra essere, quindi, un meccanismo in grado di aumentare la sensibilità di queste cellule all’apoptosi. L’analisi dell’espressione di SOCS-2 in più pazienti affetti da leucemia linfoblastica acuta (LLA) ha evidenziato che SOCS-2 è over-espresso in tutte le LAL tranne le LAL a cellule T. Questo dato suggerisce che l’azione anti-apoptotica di SOCS-2 potrebbe essere comune in più sottotipi di leucemia.