Imaging the cell entry and activity of anthrax toxins

Anthrax is a severe zoonosis, which may also affect humans, caused by pathogenic strains of the Gram-positive, spore forming Bacillus anthracis. The bacterium secretes a three-components toxic complex consisting of the protective antigen (PA), the lethal factor (LF) and the edema factor (EF). These elements combine to form lethal toxin (LeTx: PA+LF) and edema toxin (EdTx: PA+EF). LF is a zinc metalloprotease that cleaves mitogen-activated protein kinase kinases (MEKs), thereby interfering with the MAPK cascade; EF is a calmodulin-activated adenylate cyclase, which catalyses the formation of cAMP, thus altering cell signalling and tissue ion fluxes. PA binds its specific cellular receptors, then it is proteolytically activated by cellular proteases and self-associates into homo-oligomers capable of binding LF and EF. These complexes enter surface rafts, are endocytosed and reach late endosomal compartments, whose acid luminal pH causes a conformational change, which results in LF and EF release into the cell cytosol. Here, the activity of anthrax toxins, in particular of EF, is monitored with fluorescent imaging techniques and particular attention is focused on the cell entry and trafficking of anthrax toxins using LF and EF chimerae C-terminally fused to the EGFP or mCherry fluorescent proteins.

L’antrace è una zoonosi causata da Bacillus anthracis, un batterio Gram-positivo in grado di formare spore. Il batterio è in grado di secernere tre proteine, chiamate antigene protettivo (PA), fattore letale (LF) e fattore edematoso (EF), che si assemblano in maniera binaria per formare due complessi tossici chiamati tossina letale (LeTx: PA+LF) e tossina edematosa (EdTx: PA+EF) . LF è una zinco-metalloproteasi che taglia la maggior parte delle isoforme delle mitogen-activated protein kinase kinases (MEKs), interferendo con questa importante via di segnale intracellulare; EF, invece, è una adenilato ciclasi calmodulina dipendente che catalizza un forte aumento di cAMP, importante secondo messaggero, portando ad una alterazione dell’equilibrio osmotico della cellula. PA, dopo essersi legato a specifici recettori cellulari, viene tagliato da proteasi cellulari, ciò ne promuove l’attivazione e porta all’assemblamento di omo-oligomeri in grado di legare LF ed EF. Il complesso viene quindi internalizzato attraverso il processo di endocitosi e raggiunge i compartimenti tardivi, il cui pH acido favorisce un riarrangiamento conformazionale che porta alla traslocazione delle subunità catalitiche nel citoplasma cellulare. In questa tesi, l’attività delle tossine, in particolare di EF, è monitorata con diverse tecniche di microscopia e particolare attenzione è rivolta al processo di entrata e trafficking nella cellula facendo uso di chimere di LF ed EF fuse al C-terminale con proteine fluorescenti.