Studio del ruolo dei microRNA nella maturazione e nella leucemogenesi T

Maturation of T cells occurs through a series of steps and is driven by factors and mechanisms which remain poorly defined. Recent work shows that some microRNAs (miRs) are dynamically regulated in their expression during hematopoietic development, inflammation and leukemogenesis. However, little is known regarding the possible role of miRs during the physiologic development of human T cells or their significance in T cell-derived malignancies. In order to identify miRs which could be involved in the differentiation of T lymphocytes, we analyzed the expression profile of miRs in human T cell progenitors at different stages of maturation: Double Positive (DP; CD4+CD8+), Single Positive CD4+ (SP CD4; CD4+CD8-) and Single Positive CD8+ (SP CD8, CD4-CD8+). In parallel, in order to deepen our knowledge about microRNA expression in T lymphoid cells, smallRNA libraries were generated from total RNA of unsorted thymocytes, DP thymocytes, CD4+ and CD8+ mature peripheral blood lymphocytes. The array-based analysis showed that each thymic population displays a distinct miR expression profile, which reflected the developmental relationships between maturation stages in thymocytes. A general up-regulation of miR expression was observed in T precursors during the maturation from DP to SP stage. The generation of small-RNA libraries enabled us to study the expression of both known and new candidate miRs in different T lymphoid populations. In order to identify known and new candidate miRNAs among the short-RNA sequences, a computational pipeline was developed. Computational analysis of the 29.744 small-RNA sequences obtained from our libraries led to the identification of 139 sequences corresponding to known miRs and 98 sequences of new candidate miRs. A bootstrap analysis estimated that the sequence data covered more than 80% of the total content of miRs in the 4 libraries. The analysis of the libraries confirmed the general up-regulation of miR expression during T cell maturation. By comparing the array and sequence data, we identified a group of known miRs which were consistently regulated during normal T cell maturation. The modulation of the expression during T cell differentiation of some of these miR, such as miR-150, was further validated by qRT-PCR. Subsequently, for this subset of miR, we searched for potential target genes by crossing the results of 3 different target prediction softwares (Miranda, TargetScan and PicTar). Among the predicted targets for this group of miRs we found many genes involved in biologically relevant processes, including cell cycle regulation, apoptosis, differentiation and tumorigenesis. Moreover, we compared the gene expression profiles from thymic subpopulations with the list of computationally predicted targets for the most significantly regulated miRs between mature SP and DP thymocytes. By combining this approach to the pure bioinformatic approach, we identified a gene of the family of Notch receptors (Notch3), referred to as Candidate Target 1, which is known to be important in T cell differentiation and in leukemic transformation and which is concordantly predicted by 3 different target prediction softwares as a target of miR-150, one of the top up-regulated miR during T cell maturation from DP to SP stage. Moreover, Candidate Target 1 is regulated in thymocytes maturation in the opposite direction compared to miR-150. In particular, we identified a high complementarity between miR-150 and the 3’UTR of Candidate Target 1. We are now working in order to validate experimentally the association between miR-150 and Candidate Target 1. In parallel, we decided to study the functional effects of miR-150 over-expression in T-ALL cell lines. MiR-150 is expressed at very low levels in all the T-ALL cell lines tested. Interestingly, when we forced the expression of miR-150 in Jurkat T-ALL cells, we observed a significant reduction of the proliferation rate associated with the accumulation of cells in the G2 phase of cell cycle. Eventually, in order to identify patterns of miR expression that can be associated with malignant transformation, we compared the miR expression profiles of human thymocyte subpopulations to the profile of a group of T-cell lymphoblastic lymphomas (T-LBL) of childhood and to that of a group of reactive non-neoplastic lymph nodes (LN) (provided by Dr. Rosolen laboratory, Department of Pediatrics, University of Padova). The hierarchical clustering of the samples indicated that TLBLs have a group of miRs which are differentially expressed both in respect to reactive lymph nodes and to thymic healthy subsets. Interestingly, we observed that all the top 25 differentially regulated miRs during T differentiation from DP to SP stage (excluding miR-128) show a significant differential expression in T-LBL compared to at least one of the thymus populations. In the future, we plan to investigate the biological significance of some of the miRs regulated in the maturation and neoplastic transformation of T cells, playing particular attention to miR-150 role in these processes.

La maturazione delle cellule T avviene attraverso una serie di complesse modificazioni fenotipiche e genotipiche ed è guidata da fattori e meccanismi in parte ancora poco compresi. Recenti lavori hanno mostrato che l'espressione di alcuni microRNA (miR) è dinamicamente regolata nel corso dello sviluppo ematopoietico, della risposta immunitaria e della leucemogenesi. Tuttavia, attualmente, è ancora in gran parte sconosciuto il ruolo dei miR nello sviluppo fisiologico delle cellule T, nonché il significato della loro alterata espressione nella leucemogenesi T. Allo scopo di identificare miR potenzialmente coinvolti nella differenziazione dei linfociti T, abbiamo analizzato il profilo d’espressione dei miR in timociti umani a diversi stadi di maturazione: Doppi Positivi (DP; CD4+CD8+), Singoli Positivi CD4+ (SP CD4; CD4+CD8-) e Singoli Positivi CD8+ (SP CD8, CD4-CD8+). Parallelamente, al fine di approfondire la nostra conoscenza sull’espressione dei miR nelle popolazioni linfoidi T, abbiamo generato delle librerie di small-RNA a partire dall’RNA totale di timociti non frazionati, timociti DP, linfociti maturi CD4+ e CD8+ del sangue periferico. L’analisi dei dati degli array ha mostrato che ogni popolazione timica presenta un profilo d’espressione dei miR caratteristico e distinto, che riflette le relazioni fra gli stadi di sviluppo dei precursori T. Nel corso della maturazione dei precursori T dallo stadio DP a quello SP si osserva una generale up-regolazione dell’espressione dei miR. La generazione delle librerie di small-RNA ci ha permesso di studiare l’espressione sia dei miR noti, che di nuovi candidati miR nelle diverse popolazioni linfoidi T. Al fine di identificare i miR noti e nuovi potenziali fra le sequenze delle librerie di small-RNA, è stata sviluppata una pipeline bioinformatica. L’analisi computazionale delle 29.744 sequenze di small-RNA ricavate dalle nostre librerie ha portato all’identificazione di 139 sequenze corrispondenti a miR noti e 98 sequenze di candidati nuovi miR. Mediante un'analisi bootstrap, è stato calcolato che, per tutte e 4 le librerie, il set di miR maturi sequenziati rappresenta più dell'80% della totalità dei miR che si stima siano espressi nei campioni. L’analisi delle librerie ha confermato la generale up-regolazione dell’espressione dei miR nel corso della maturazione delle cellule T. Comparando i dati degli array e del sequenziamento delle librerie, è stato individuato un gruppo di miR noti che sono consistentemente regolati durante la differenziazione T. Il pattern di espressione nei diversi stadi di sviluppo T di alcuni di questi miR, tra cui miR-150, è stato validato mediante qRT-PCR. In seguito, abbiamo fatto una ricerca dei target potenziali di questi miR integrando i risultati di 3 diversi software di predizione di target (Miranda, TargetScan and PicTar). Fra i candidati target del gruppo di miR d’interesse sono stati identificati molti geni coinvolti in processi biologici rilevanti, come la regolazione del ciclo cellulare, l’apoptosi, il differenziamento e la tumorigenesi. Inoltre, abbiamo confrontato i profili di espressione genica delle popolazioni timocitarie con la lista di target predetti computazionalmente per i miR regolati con maggiore fold-change nel corso della differenziazione dei timociti da DP a SP. Combinando quest’ultimo approccio alla ricerca bioinformatica integrata di target, abbiamo identificato un gene della famiglia dei recettori Notch (Notch3), definito Candidate Target 1, che è noto giocare un ruolo importante nella differenziazione T e nella trasformazione leucemica e che viene predetto, in modo concorde da tre diversi software di predizione di target, come bersaglio di miR-150, uno dei miR maggiormente up-regolati nelle popolazioni timocitarie mature rispetto ai DP. Inoltre, il trascritto di Candidate Target 1 risulta regolato in modo opposto al miR-150 nel passaggio dei timociti dallo stadio DP a quello di SP CD4. In particolare, abbiamo identificato un'elevata complementarietà fra il miR-150 e l'UTR-3' del gene Candidate Target 1. Attualmente stiamo lavorando per validare sperimentalemente l’associazione fra miR-150 e Candidate Target 1. In parallelo, abbiamo deciso di studiare gli effetti funzionali dell’over-espressione di miR-150 in linee cellulari di T-ALL. MiR-150 è espresso a livelli molto bassi in tutte le linee cellulari di T-ALL analizzate. Inducendo l’espressione forzata di miR-150 nella linea di T-ALL Jurkat, abbiamo osservato un significativo rallentamento del tasso di proliferazione cellulare associato ad un accumulo delle cellule in fase G2. Infine, allo scopo di identificare pattern di espressione dei miR associati alla trasformazione neoplastica T, abbiamo confrontato i profili d’espressione dei miR delle sottopopolazioni timocitarie umane con il proflo di un gruppo di linfomi linfoblastici T (T-LBL) pediatrici ed un gruppo di linfonodi reattivi non neoplastici (LN) (forniti dal laboratorio del Dott. Rosolen, Dipartimento di Pediatria, Università di Padova). Il clustering gerarchico dei campioni ha mostrato che i T-LBL hanno un profilo d’espressione dei miR distinto sia da quello delle sottopopolazioni timocitarie, sia da quello dei linfonodi reattivi. Abbiamo inoltre osservato che tutti i 25 miR maggiormente regolati nel passaggio dei timociti dallo stadio DP a SP (a parte miR-128) risultano espressi in modo differenziale nei T-LBL rispetto ad almeno una delle popolazioni timiche. Nel futuro, ci proponiamo di investigare il significato biologico di alcuni dei miR regolati nella maturazione e la trasformazione neoplastica delle cellule T, ponendo particolare attenzione al ruolo di miR-150 in questi processi.