STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI ALLA BASE DEL COINVOLGIMENTO DEI MULTIVESICULAR BODY NEL CICLO REPLICATIVO DEL CITOMEGALOVIRUS UMANO

The eucaryotic endosomal system is a complex network of vesicles and organelles surrounded by membranes which coordinates protein transport between the plasma membrane, the trans-Golgi network (TGN) and the lysosomes. A central role at this level is played by an organelle named multivesicular body (MVB). Several proteins involved in the MVB biogenesis are essential for budding of RNA-enveloped viruses, like retroviruses (Göttlinger et al., 1991), rhabdoviruses, filoviruses (Strack et al., 2000), arenaviruses and paramyxovirus (Strack et al., 2003). More recently it has been clarified that also some DNA-enveloped viruses, and in particular Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) (Calistri et al., 2007; Crump et al., 2007), Hepatitis B Virus (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007), Human Herpes Virus type 6 (HHV-6) (Mori et al., 2008) and Human Cytomegalovirus (HCMV) (Tandom et al., 2009), exploit the MVB membranes for their assembly and budding. The more accredited view concerning herpesviruses envelopment and budding is the ‘double envelopment theory’, envisioning that virion acquires at the level of the inner leaflet of the nuclear membrane a primary envelope, that it is lost by budding from the outer nuclear membrane. Finally, virions acquire the secondary and final envelope at the level of intracytoplasmic membranous organelles. HCMV morphogenesis is completed in a virally induced perinuclear compartment, referred as ´assembly compartment’ or ‘assembly complex’ (AC). This project moves from the data obtained in our laboratory regarding HSV-1 gB as one of the protein linking the virus to the MVB pathway. Indeed, the glycoprotein colocalizes with well-known MVB markers and its intracellular trafficking and maturation require the correct biogenesis of these organelles. Furthermore, gB is ubiquitinated in the C-terminal tail at the level of residues involved in endocytosis and trafficking between endosomes, TGN and lysosomes (Calistri et al., 2007). The aim of this work was to contribute to elucidate whether other viruses of the Herpesviridae family hijack the same cellular pathway and whether the HSV-1 gB behaviour is conserved among some glycoprotein homologs. In particulare, we decided to focalized our attention on HCMV gB (UL55). By immunofluorescence assays (IF) we observed that the MVB block results in the gB accumulation both in the cytoplasm and in membrane compartments and in the gB relocalization at the level of intracytoplasmic enlarged vesicles positive for the endosomial marker EEA-1, while in infected cells the glycoprotein recruitment to the AC is impaired. Therefore, these data suggest that, like for HSV-1 gB, also UL55 intracellular trafficking requires a functional MVB biogenesis. Moreover, in support to a role for MVBs/lysosomes in gB fate, we were able to show that, in transfected cells, the glycoprotein accumulates in the presence of the lysosome inhibitor bafilomycin. UL55 contains a PPxY domain, that matches the consensus sequence for ligands recognized by the E3 ubiquitin ligases of the Nedd4 family. Our results show that UL55, but not UL75 (gH), is ubiquitinated both in infected and transfected cells and that the Nedd4-like ubiquitin ligases specifically interact with HCMV gB through its PPSY motif and are involved in its ubiquitination and lysosomial degradation. We also analyzed the AMSH and UBPY role in UL55 deubiquitination. Consistently to the model reported in literature (Welchman et al., 2005), our results suggest that AMSH causes the UL55 deubiquitination for its recycling, while UBPY deubiquitinates it to permit its MVB incorporation. As a further evidence of the MVB involvement in the UL55 intracellular fate the HCMV glycoprotein, but not HSV-1 gB nor the Pseudorabies Virus gB (UL27), interacts also with another protein essential for the MVB biogenesis, Tsg101. From the literature it is known that proteins interacting with this MVB component contain a P(T/S)AP L-domain. Since UL55 does not contain such a consensus sequence, we investigated the possible mechanism for this interaction. We excluded that the binding could be mediated by the ubiquitin ligases Nedd4-like or other adaptor proteins recruiting at the endosomes or at the TGN ubiquitinated cargoes addressed to the MVBs (Hrs, GGAs, Toms). Moreover, we clarified that the interaction between UL55 and Tsg101 depends on the glycoprotein cytoplasmic tail and the N-terminal UEV (ubiquitin E2 variant) domain of Tsg101. On the other hand, Tsg101 mutants in the UEV that do not interact with the ubiquitin nor with the P(T/S)AP L-domain of HIV-1 Gag p6 domain, continue to co-immunoprecipitate with UL55. Finally, confocal miscroscopy highlighted that Tsg101 is recruited to the AC during the infection. Further experiments will shed light on the molecular mechanism needed for this interaction. To move our UL55 characterization toward a functional and biological analysis, we built, by employing BAC mutagenesis, recombinant viruses carrying gB specific mutations or lacking the glycoprotein coding sequence. The analysis of these mutants in terms of viral growth, protein localization (analyzed by IF) and virion maturation and egress (analyzed by electron microscopy assays) will clarify the role of the interactions between UL55 and MVB proteins for the HCMV life cycle. Overall, our data point out to HCMV gB, in a simil way to HSV-1 gB, as the key protein that links HCMV envelopment-egress to the MVB pathway.

Il sistema endosomiale delle cellule eucariotiche è una complessa rete di compartimenti membranosi che coordinano il trasporto delle proteine tra la membrana plasmatica, il trans-Golgi network (TGN) ed i lisosomi. Un ruolo centrale a questo livello è svolto da un organello identificato con il termine multivesicular body (MVB). Numerose proteine coinvolte nella biogenesi di questo pathway sono essenziali per la gemmazione di virus ad RNA dotati di envelope come retrovirus (Göttlinger et al., 1991), rhabdovirus, filovirus (Strack et al., 2000), arenavirus e paramyxovirus (Strack et al., 2003). Più recentemente è stato chiarito che anche alcuni virus a DNA dotati di envelope, ed in particolare l’herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) (Calistri et al., 2007; Crump et al., 2007), il virus dell’epatite B (HBV) (Lambert et al., 2007; Watanabe et al., 2007), l’herpes virus umano di tipo 6 (HHV-6) (Mori et al., 2008) ed il citomegalovirus umano (HCMV) (Tandom et al., 2009), sfruttano le membrane dei MVB per assemblaggio e gemmazione. La teoria attualmente più accreditata riguardo al processo di acquisizione del pericapside ed al meccanismo di gemmazione degli herpesvirus è la teoria del doppio envelopment in base alla quale il virione acquisisce a livello della membrana nucleare interna un envelope primario, che viene perso per gemmazione dalla membrana nucleare esterna. Il virione acquisce, infine, l’envelope secondario e definitivo a livello di organelli intracitoplasmatici di natura membranosa. La morfogenesi di HCMV è completata in un compartimento perinucleare che il virus forma durante l’infezione noto come assembly complex o assembly compartment (AC). Questo progetto nasce dalle evidenze messe in luce nel nostro gruppo di ricerca che dimostrano come la glicoproteina gB di HSV-1 svolga un ruolo centrale nel permettere al virus di sfruttare il pathway dei MVB durante le fasi finali del proprio ciclo replicativo. La glicoproteina, infatti, colocalizza con noti marcatori dei MVB ed il suo traffico intracellulare e maturazione richiedono la corretta biogenesi di questi organelli. Inoltre, gB è ubiquitinata a livello della coda C-terminale dove si localizzano i residui coinvolti in endocitosi e trafficking intracellulare (Calistri et al., 2007). Partendo dal presupposto che gB è una delle glicoproteine più conservate tra gli herpesvirus, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare se anche nel caso di altri virus appartenenti alla famiglia Herpesviridae, che sembrano utilizzare i MVB per la propria maturazione e/o gemmazione, questa glicoproteina rappresenti uno degli anelli di congiunzione tra virus e pathway cellulare. In particolare, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla gB di HCMV (UL55), essendo le evidenze a sostegno del ruolo dei MVB nel ciclo replicativo di questo virus ancora contraddittorie (Fraile-Ramos et al., 2007; Tandom et al., 2009). Mentre normalmente questa glicoproteina localizza a livello dell’AC (Sanchez at al., 2000), abbiamo dimostrato attraverso saggi di immunofluorescenza (IF) che, in cellule nelle quali la biogenesi dei MVB viene bloccata, gB rimane dispersa nel citoplasma delle cellule infettate. In cellule trasfettate, invece, il blocco della biogenesi di questo pathway ne determina l’accumulo sia a livello intracellulare sia in compartimenti membranosi e la rilocalizzazione a livello di siti positivi per EEA-1 (early endosomal antigen-1), un marcatore degli endosomi precoci. Questi dati suggeriscono il coinvolgimento dei MVB e la necessità della loro corretta biogenesi nel trafficking anche della gB di HCMV. Inoltre, i nostri dati mostrano che UL55, ma non altre glicoproteine di HCMV, quali UL75 (gH), è ubiquitinata sia in cellule infettate sia in cellule trasfettate con costrutti che mediano la sua espressione. Significativamente, abbiamo osservato che UL55 presenta un sequenza PPSY, reminiscente del motivo PPxY, sequenza consenso che media l’interazione con proteine caratterizzate da domini WW, quali le ubiquitino ligasi E3 della famiglia Nedd4 (Strack et al., 2000). Infatti, siamo stati in grado di dimostrare che le ubiquitino ligasi di questa famiglia, che sono implicate nella biogenesi dei MVB (Staub et al., 1997), interagiscono fisicamente con UL55, proprio attraverso il motivo PPSY, e sono coinvolte nella sua ubiquitinazione e nella sua degradazione lisosomiale, almeno in condizioni di over-espressione. In particolare abbiamo osservato che: i) quando sovraespresse le ubiquitino ligasi portano ad una significativa riduzione dei livelli di UL55 in cellule co-trasfettate con il costrutto esprimente la glicoproteina virale; ii) almeno in condizioni di sovraspressione, UL55 si accumula nelle cellule in presenza dell’inibitore dei lisosomi bafilomicina. Il complesso ruolo giocato dall’ubiquitinazione nel trafficking di UL55 è stato ulteriormente dimostrato indagando la funzione svolta, a questo livello, dalle due de-ubiquitinasi AMSH e UBPY, entrambe attive a livello dei MVB (Clague and Urbè, 2006). Coerentemente al modello prevalente in letteratura (Welchman et al., 2005), i nostri risultati suggeriscono che AMSH sia coinvolta nella deubiquitinazione di UL55 al fine di favorire il suo reciclo, mentre UBPY la deubiquitini per permetterne l’incorporazione nei MVB. A dimostrazione ulteriore del coinvolgimento dei MVB nel destino intracellulare di UL55, quest’ultima, ma non gB di HSV-1 nè gB del virus della pseudorabbia (UL27), interagisce anche con Tsg101, un’altra proteina fondamentale per la biogenesi dell’organello cellulare. È noto che le proteine che interagicono con tale componente dei MVB contengono un dominio aminoacidico ricco in proline di tipo P(T/S)AP. UL55 non contiene sequenze consenso sovrapponibili a tale motivo e i nostri dati permettono di escludere che il legame sia mediato dalle ubiquitino ligasi Nedd4 o da alcune proteine adattatrici, che reclutano a livello endosomiale e del TGN proteine ubiquitinate destinate ai MVB (Hrs, GGA, Tom). Abbiamo, invece, dimostrato che il legame tra UL55 e Tsg101 è mediato dalla coda citoplasmatica della glicoproteina e dal dominio N-terminale UEV (ubiquitin E2 variant) di Tsg101. Mutanti di Tsg101 a livello del dominio UEV che non legano più l’ubiquitina o L-domain di tipo P(T/S)AP, invece, continuano ad interagire con UL55. Infine saggi di IF in cellule infettate hanno messo in luce che la proteina Tsg101 è reclutata all’AC. Ulteriori esperimenti chiariranno il meccanismo molecolare alla base di questa interazione. Consapevoli che i dati ottenuti, pur indicando un ruolo chiaro per i MVB nel trafficking della gB di HCMV, erano stati ottenuti principalmente in cellule trasfettate, abbiamo voluto analizzare la rilevanza funzionale e biologica dei nostri risultati ottenendo, mediante mutagenesi basate sulla strategia BAC (bacterial artificial chromosome), virus ricombinanti caratterizzati da specifiche mutazioni a livello di UL55 o dalla sua completa delezione. L'analisi di questi mutanti in termini di crescita, localizzazione intracellulare di specifiche proteine virali e/o cellulari (saggi di IF) e maturazione/gemmazione dei virioni (saggi di microscopia elettronica) chiariranno il ruolo delle interazioni tra UL55 e le proteine dei MVB nel ciclo replicativo di HCMV. Nel complesso fino a questo momento i nostri dati mostrano che UL55, come la gB di HSV-1, è una delle proteine chiave che associa envelopment e gemmazione virali al pathway dei MVB.