CARATTERIZZAZIONE QUALITATIVA, EVOLUZIONE DELLA FRESCHEZZA E IDENTIFICAZIONE DI SPIGOLE (Dicentrarchus labrax L.) PROVENIENTI DA DIFFERENTI SISTEMI DI ALLEVAMENTO

Qualitative characterization, freshness evolution and identification of European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) from different rearing systems This PhD thesis is divided into four main sections: introduction, objectives, material and methods, results and discussion and is concluded by general considerations and reference list. Introduction In this section, world and national statistics on wild captures and cultivated fish production are reported, with detailed information on European sea bass production in the Mediterranean basin. Morphological traits and ecological needs of sea bass are described, as well as the equipments and techniques for artificial reproduction and fattening. The second part of the work is dedicated to outline the state of art on the specific items that have been investigated here, that are the characterization of biometric traits, chemical composition and dietetic value of fish and sea bass, the food safety, with the problem of PCB and heavy metal contamination, the assessment of freshness evolution and, lastly, the possible utilization of NIR spectroscopy for the characterization and origin identification of fish and fish product. European sea bass, together with sea bream, is the main fish species reared in Italy after trout. The great competition existing among producing Countries of the Mediterranean area (especially Turkey, Greece, Spain, Croatia) and the relative consequences on market prices require the national product to be characterized for quality and food safety at origin. Even if with some differences among Countries, European consumers give increasing attention to food safety and are especially worried about the possible presence of inorganic and organic persistent pollutants in fish products. On one hand wild and cultivated fish have recognized higher nutritional quality in comparison with terrestrial animals, thanks to the high concentration in poly-unsaturated fatty acids of the ω-3 series, on the other hand fish products are more sensible to accumulate contaminants which concentrate along the natural trophic chain or may be present in commercial feeds. The control of heavy metals and polychlorinated biphenyl (PCB) concentration has a key role, because these pollutants are concentrated in the meat of carnivorous animals at the top of the trophic chain and their presence, even if still debated, is associated to various metabolic, hormonal and reproductive diseases as well as the occurrence of cancers. In post-mortem, fish product quality is strictly correlated to the degree of freshness and storage condition. These characteristics may be evaluated by different means based on analytical determination of degradation metabolites, as well as on sensory methods based on standard EU methods (Reg. EC 2406/96) or more recently-developed schemes adapted to the different species and product category (Quality Index Method, QIM). Among innovative methodologies, Near Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) may be successfully used for a full evaluation of fresh and stored fish products. Largely used to evaluate nutritional characteristics of livestock feedstuffs, characterize and identify the origin, and detect adulterations in a wide range of products, NIRS analysis has been successfully apply also to fish products to predict flesh composition of various species, besides identify their origin and evaluate their freshness. Objectives With the main aim of contributing to reinforce programs for global quality, food safety and sea bass promotion by means of a wide study about biometric, chemical, dietetic, sensorial and toxicological traits of fish of various commercial sizes and coming from farms with different productive systems as well as geographic locations along Italy, the present thesis developed the following specific objectives: Objective 1 - QUALITY. Characterization of morphological, chemical and nutritional traits of sea bass coming from Italian farms with different rearing systems. Objective 2 - POLLUTANTS. Determination of the presence and concentration of persistent environmental pollutants (PCB and heavy metals) in sea bass from Italian farms with different rearing systems. Objective 3 - FRESHNESS. Evaluation of freshness change in reared sea bass as affected by storage duration and productive system. Objective 4 - NIRS. Using NIRS analysis to characterize chemical and nutritional composition, to evaluate freshness and identify the origin of sea bass from different rearing systems. Material and Methods Sampling Four groups of sea bass were caught and analysed at different moments: Sampling no. 1: 133 sea bass from four farms with different rearing system (extensive valley, semi-intensive ponds, intensive tanks, intensive sea cages). Sampling no. 2: 170 sea bass of two commercial sizes (400-600 g and 700-1000 g) coming from 11 Italian farms and belonging to three rearing systems (extensive valley, intensive tanks, intensive sea cages). Where used and when possible, the commercial diet fed to sea bass during the last period of growth before caught was sampled. Sampling no. 3: 90 sea bass taken in a different moment from the same semi-intensive farm used for the sampling no. 1. Sampling no. 4: 90 sea bass from three farms with different rearing systems (extensive valley, intensive tanks, intensive sea cages) and already used for sampling no. 1 and 2. Sample preparation and analyses After caught and sacrificed in water and ice, sea bass were submitted to the following preparation and analyses: • sensorial evaluation of freshness by the standard EU scheme (Reg. EC 2406/96) and two QIM (Quality Index Method) schemes; • biometries and morphometric indexes: total length, standard length, maximum height and head length were measured and used to calculate the condition factor, relative profile, and cranial index; • skin colour (L*a*b*) at 3 dorsal and 2 ventral points by spectrophotometer; • texture profile analysis (TPA) of the whole fish by dynamometer; • eye pH; • gut and internal organs were removed and weighed: gut, liver, perivisceral fat, gonads; fillets with skin were separated from eviscerated carcass and weighed; hepatosomatic index, viscerosomatic index, mesenteric fat index, gonadic index, carcass and fillet percentages were calculated; • fillet colour (L*a*b*) at 3 dorsal and 2 ventral points by spectrophotometer • fillet pH at three dorsal points; • fillet texture profile analysis (TPA); • NIRS analysis of fresh minced filled without skin by monocromator spectrometer within 1100 and 2500 nm wavelengths; • lipid extraction and fatty acid profile of muscular fat by gas-chromatography; • total volatile basic nitrogen (TVBN) in fresh minced fillet; • freeze-drying of fillets; • NIRS analysis of freeze-dried fillets as for fresh fillets; • chemical characteristics (water, ether extract, protein, ash) and energy content of freeze-dried fillets; • heavy metals concentration in fillets and diets by ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) after sample mineralization; • PCB concentration in fillets and diets. For sea bass of sampling no. 1, 12 congeners were determined representative of PCB contamination, among which the 7 indicator congeners (28, 52, 101, 118, 138, 153 e 180). On 18 pool of fillets and 7 diets of sampling no. 2, PCB were measured as concentration and sum of equivalent toxicity (TEQ) of the 12 dioxin-like PCB congeners. Data treatment and statistical analyses Objective 1 - Quality. Biometric data and morphometric indexes (samplings no. 2, 3, and 4) and analytical data (samplings no. 1, 2, 3, and 4) were submitted to analysis of variance (ANOVA) by GLM procedure (SAS), considering as main variability factors the rearing system and fish size. Objective 2 - Pollutants. Data of heavy metals and PCB concentrations were submitted to analysis of variance considering the rearing system as main factor (samplings no. 1 and 2). For data of sampling no. 2, fish live weight at slaughter was included as covariate in the model. Besides, correlation coefficients and regressions were calculated between fish live weight and ether extract concentration; fish live weight and PCB concentration (ng/g fat); ether extract and PCB concentration (ng/g fat). Objective 3 - Freshness. Morphometric and analytical data were submitted to analysis of variance with storage time (samplings no. 3 and 4) and rearing system (sampling no. 4) as main factors. The results of sensory evaluation were analyzed by Proc UNIVARIATE (SAS). Data with normal distribution were submitted to Proc. GLM; data with non-normal distribution were analysed by non-parametric analysis of variance (Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests) with Proc. NPAR1WAY. Objective 4 - NIRS. Spectra were taken in reflectance, transformed in absorbance and derivatized (2, 20, 20). Calibrations to predict the chemical composition of fillets and some carcass characteristics were calculated by Partial Least Square Regression (PLSR) on derivatized spectra and validated by full cross-validation. Principal Component Analysis (PCA) and Soft Independent Modelling Class Analogy (SIMCA) were used to discriminate and classify samples according to origin (samplings no. 2 and 4) and storage time (samplings no. 3 and 4). Results Objective 1 - Quality The rearing system significantly affected morphologic, biometric and reologic traits, besides chemical composition of sea bass. In fish of sampling no. 2, the carcass percentage was significantly higher (P<0.05) in sea bass from extensive systems (87.7%) in comparison with those reared intensively in sea cages (85.9%) and similar to that of sea bass reared intensively in concrete tanks (87.0%). Fillet percentage was lower in extensively-reared sea bass compared to fish of the other systems (46.1 vs. 48.5%). The index of mesenteric fat was lower in sea bass reared in sea cages in comparison with those from extensive valleys or land intensive systems (2.21 vs. 3.40 and 4.24%; P<0.05). In sampling no. 4, differences among rearing systems were even accentuated. In both samplings, the intensity and saturation of red and yellow colour indexes were greater in sea bass from extensive rather than from land intensive system and, even more, than in those from sea cages (P<0.05). Further differences were evidenced in the TPA of whole fish (sampling no. 4), with the maximum force for the first compression significantly higher in sea bass from extensive and sea cages systems compared to those from land intensive systems (29.2 and 26.7 vs. 21.8 N; P<0.001). Fillet pH was higher (P=0.02) in fish from sea cages (6.42) than in those from extensive or land intensive systems (6.28 and 6.29). In all samplings (no. 1, 2), fillets from extensive farms had less muscular fat (P<0.01) compared to intensively-reared sea bass (in tanks, ponds or sea cages). Moreover, fillets from fish coming from intensive tanks were fatter that those from sea cages (P<0.05). Energy content of fillets increased with fat content, while water concentration decreased. The size of sea bass (small and large; sampling no. 2 on 11 farms distributed along Italy) affected significantly biometric traits, relative profile and cranial index, but to a limited extent in absolute value. Heavier sea bass showed higher condition factor and higher incidence of losses at evisceration (hepatosomatic index) (P<0.001), even if carcass percentage did not change (P>0.05). The percentage of fillets was higher in large than in small fish (48.2 vs. 47.2%; P=0.05). The size of sea bass did not affect the skin colour indexes except for L* values in the dorsal side of fish, showing higher brightness in sea bass of small size (42.6 vs. 39.7; P<0.05). Fillet chemical composition was not significantly affected by the commercial size of sea bass. Sampling no. 3, with sea bass from only one farm with semi-intensive system, was used to obtain information on acidic profile of muscular fat. Saturated fatty acids were 26.5% of total fatty acids, with palmitic acid as the most represented. Monounsaturated fatty acids were 34.5%, with oleic acids reaching 50% of them. The content of polyunsaturated fatty acids (PUFA) was 34.4% on average, with a light prevalence of ω-3 PUFA (17.3%) on ω-6 PUFA (15.8%) series. Within ω-6 PUFA, the main acids was alpha-linoleic; within ω-3 PUFA, eicosapentaenoic and docoesaenoic acids were the most abundant. Objective 2 - Pollutants In sea bass of sampling no. 1, the rearing system significantly affected the total concentration of the 12 most abundant PCB (PCBtot) and the 7 PCB indicators (PCB7), which were less concentrated in extensively-reared sea bass (112.0 and 74.6 ng/g fat, respectively) in comparison with sea bass from the other rearing systems (on average 179.7 and 123.2 ng/g fat, respectively) (P<0.001). When concentrations were given on fresh muscle weight instead of on fat weight, PCBtot and PCB7 levels were lower in extensively-reared sea bass (3,412 and 2,266 ng/g fresh weight, respectively), intermediate in sea bass from semi-intensive ponds (15,398 and 10,632) and from sea cages (13,123 and 8,882), and higher in intensively-reared sea bass (18,176 and 12,440) (P<0.001). Within rearing system, ether extract concentration of the fillet and slaughter live weight were positively correlated (r=0.79). PCB7 concentration expressed on g fat was positively correlated with both sea bass slaughter weight (r=0.71) and fillet fat concentration (r=0.86). The correlation between fish slaughter weight and fillet fat concentration increased (r=0.73 and 0.96, respectively) when PCB7 was given on fresh weight basis. The correlation degree between PCB7 concentration on fresh weight and sea bass slaughter weight was affected by the rearing system, while the correlation between PCB7 and fat concentrations in fillets was not. The total content of the 12 dioxin-like PCB in diets obtained in the frame of sampling no. 2 (and fed to sea bass during the last period of growth) was higher in sea-cage farms G1 (29.35 ng/g fat) and G3 (15.80 ng/g fat) followed by the intensive farms I1 and I3 (12.72 and 12.62 ng/g fat, respectively), while very low contaminations were found in diets of the other farms. In fillets, depending on the rearing systems, only concentrations of PCB congeners no. 126 and 189 significantly changed, but the variations in PCB no. 126, low concentrated but very toxic, determine the major changes in fish toxicity equivalent (TEQ). The highest value of TEQ was in fact measured for PCB no. 126 in fillets of sea bass from extensive systems (19.7 pg/g fat; P=0.05) rather than in those from intensive systems (7.6 pg) or sea cages (11.0 pg). As a consequence, the sums of toxicity equivalents (ΣTEQ), expressed in g fat, significantly changed (P=0.05) according to the rearing system with the highest values in extensive farms compared to land or sea cage intensive systems (21.9 vs. 8.89 and 12.6 pg/g fat, respectively). When expressing data on fresh weight basis, however, ΣTEQ was not significantly different among rearing systems (from 0.72 to 0.83 pg/g fillet). The size of fish did not affect dioxin-like PCB concentrations and ΣTEQ, both when expressed on fat and on fresh weight. In sea bass of sampling no. 1, PCB7 concentration (75-131 ng/g fat) was always lower to the limit (200 ng/g fat) established in 1999 by the European Union Regulations for swine and poultry meat and derived products for human consumption. On 2006, the European legislation established for fish and fish products a maximum concentration of dioxins and furans equal to 4.0 pg TEQ/g fresh weight and the sum of dioxins, furans and dioxin-like PCB equal to 8.0 pg TEQ/g fresh weight. In fillets coming from sampling no. 2, also the highest dioxin-like PCB concentration found in an extensive farm (TEQ 45.3 pg/g fat equal to 0.735 pg/g fresh weight) was largely below law limits. As what concerns heavy metals, great differences were found in the metal concentrations in the feed sampled in the different farms: arsenic concentration was higher in farms G1 and I2 and lower in farms E3, I1, I3, G3 and G4. The concentration of the other metals was less variable among diets. None of the analysed samples contained mercury at a detectable level, while zinc and copper concentrations were rather abundant, likely because of the commercial diet supplementation. Rearing system significantly affected heavy metal concentration in flesh. When detectable, mercury concentration ranged from 0.023 to 0.152 mg/kg DM, with the highest values in extensively-reared sea bass, but always lower than the 0.5 mg/kg fresh weight established by the EU rules. Arsenic was found at high concentrations (12-15 mg/kg DM) in one of the extensive farms, while ranged from 1 to 3 mg/kg DM in most cases, and was even below 1 mg/kg DM in some farms. Copper concentration of extensively reared sea bass was lower than in fish from land and sea cage intensive systems (0.82 vs. 1.03 and 1.06 mg/kg fresh weight; P<0.01). Fillet lead concentration, even if not statistically different, was higher in sea bass from intensive systems (0.13 mg/kg fresh weight). In two out of the four intensive farms, this value (0.22 and 0.30 mg/kg fresh weight) was higher than the law limits, that is 0.20 mg/kg fresh weight. Also arsenic concentration was 3-4 fold higher in extensively-reared sea bass than in sea bass from land or sea cages intensive systems, even if with a low statistical significance (P=0.12). The size of fish did not affect heavy metal concentrations. Objective 3 - Freshness Freshness evolution was evaluated on sea bass of sampling no. 3, for which the effect of storage time was considered, and on Set n. 4 for which the effects of both storage time and rearing systems were evaluated. The sampling no. 3 consisted of 90 sea bass coming from a semi-intensive farm and stored in groups of 15 specimens during 0, 1, 2, 4, 6 and 8 days in boxes without ice and in a refrigerated room at 2°C. During storage, biometric and carcass traits little varied. At the sensorial evaluation, 8 days after slaughter, sea bass showed a still acceptable degree of freshness, even if some traits (shining, mucus presence, hardness for general aspect; gill odour and mucus) degraded quickly in comparison with other traits. Eye characteristics did not change and the loss of colour at abdomen was limited, while abdomen consistency and the odour of cloacae impaired to an intermediate degree. The regression between QIM scores from 0 to 8 days of storage was explained by a high coefficient of determination (R2=0.95), with a linear (increase with the time of storage) and quadratic evolution (reduction of the increase in value with the days of storage). Among rheological measurements, eye pH decreased from 7.25 at day 0 to 7.04 at day 4 to increase again at 7.48 after 8 days of storage (linear and quadratic component of variance, P<0.001), while fillet pH did not change. During storage, skin lightness linearly increased with days from 44.8 to 52.3, with the highest value after 2 days of storage; the red index moved from positive values around zero to minimum values tending to green; the reduction of b* index evidenced a corresponding reduction of yellow component (from 5.63 to 2.42) with a quadratic trend (Q=0.02). As what concerns fillet colour, lightness increased with storage length (L<0.001 and Q<0.01). The indexes a* and b* increased on day 1 and 2 and then decreased after 6-8 days of storage (L<0.01; Q<0.05). Fillet texture significantly changed: hardness increased from slaughter (4.86 N on day 0) to day 4 of storage (7.20 N), then decreased on days 6 and 8 (L<0.001; Q=0.02) according to the onset and resolution of rigor mortis. The value of elasticity linearly decreased (L=0.09), even if the lowest values were measured 1 and 2 days after slaughter (Q<0.01). As what regards the chemical composition, during storage, the total volatile basic nitrogen concentration increased (from 15.6 to 16.5 mg/100 g; L<0.001). When considering the fatty acid profile of sea bass fillet fat, the concentration of palmitic acid decreased linearly from 17.8 to 17.1% with increasing days of storage, while changes in stearic acid were limited in absolute value even if significant at a statistical level. The concentration of mono-unsaturated fatty acids did not change, while, among ω-6 polyunsaturated fatty acids (PUFA), the concentration of alpha-linoleic acid was higher after 8 days of storage. Arachidonic acid, present in small amounts, significantly decreased its concentration during storage. Among ω-3 PUFA, linolenic acid linearly increased (from 2.04 to 2.23%), while eicosapentaenoic and, expecially, docosahexaenoic acids significantly diminished with the days of storage. The analyses of further 90 sea bass (sampling no. 4) from three farms with different rearing systems (extensive, land intensive and intensive sea cages) and stored for 3, 6, 10, 13 and 17 days in boxes covered with ice and kept in a refrigerated room at 2°C confirmed the absence of an effect of the storage time on biometric traits and carcass and fillet percentages. The sensorial evaluation confirmed a significant increase of QIM scores and a high correlation (R2 from 0.84 to 0.95 depending on the farm considered) with the days of storage. The QIM evolution, however, evidenced a curvilinear trend, with a quick freshness degradation during the first days, which was slow until 10-13 days of storage (normalized QIM corresponding to 30-35% of the total loss of freshness) and, at last, fast between 13 and 17 days of storage, when freshness impairment reached 65-70%. The complete loss freshness in the storage conditions used in the present trial was estimated to occur around 20-21 days. The curvilinear trend of QIM score has to be attributed to the different speed of degradation of the different sensorial traits analysed: skin aspect and sea bass consistency impaired quickly after 3 days of storage, as well as gills traits (odour and colour). On the contrary, eye (cornea, pupil, shape) and abdomen traits (colour and appearance of the cloaca) were rather stable and impaired to an appreciable extent only after 13 days of storage. During storage, skin colour and sea bass texture changed as described for fish of sampling no. 3: hardness of the whole fish progressively diminished from 3 to 17 days of storage (from 28.9 to 23.4 N; P<0.01) according to rigor resolution. Fillet pH was stable until 13 days (about 6.30) and then increased to 6.45 (P=0.10) on day 17. As what concerns the rearing system, fish coming from extensive systems showed a slower impairment of freshness at the sensorial evaluation compared to intensively-reared sea bass and, especially, specimens from sea cages (P<0.001), while other variables did not change. In fish from sea-cages, within day of storage, skin appearance, fish consistency and eye traits were less “fresh” in comparison with fish from the other rearing systems. On the other hand, sea bass from intensive systems were also scored better for haemorrhages occurrence (P<0.10), that is there were likely some differences in sea bass management before and during slaughter in the different farms. Objective 4 - NIRS NIRS prediction of sea bass chemical composition was suitable and satisfying on both fresh minced (sampling no. 3) and freeze-dried fillets (sampling no. 2) with determination coefficients in validation (R2v) that were high for water (0.95-0.97), ether extract (0.96-0.98) and gross energy (0.94-0.95). The prediction of crude protein on both samplings gave a lower correlation degree between spectral data and fillet composition (R2v=0.72-0.73) compared to the other chemical constituents, even if good in absolute value. The validation error (SECV) for the various chemicals varied with the range of variability in the sample set, but always gave a good (water, ether extract, energy) or acceptable (crude protein) accuracy of prediction. NIRS prediction of fatty acid concentration in sea bass muscles on fresh minced fillets (sampling no. 3) was not encouraging. Only for few variables, the correlation coefficient in calibration was higher than 0.50 (palmitic acid, saturated fatty acids, alpha-linoleic acid, docoesaenoic acid) and always with a too high SECV. In the calibration set of sea bass of sampling no. 2 (11 farms with different rearing systems), NIRS analysis was used also for predicting some variables linked to the animal morphology as well as some carcass traits. NIRS prediction of the condition factor was successful and with a limited error (R2cv=0.79, SECV=0.09); calibrations for slaughter weight and fillet percentages were acceptable (R2cv=0.48-0.55), while the prediction of carcass percentage was weak. NIRS analysis of fresh minced fillets of sea bass stored along 8 days (sampling no. 3) showed a good correlation between spectral data and storage duration expressed in days (R2cv=0.95; SECV=0.89 days). Grouping the most fresh samples (at days 0, 1 and 2) with those stored for some time (4, 6 and 8 days) improved the error of prediction, by reducing it to 0.75 days. The model-to-model distance in SIMCA was insufficient to classify fillets stored for 1 and 2 days (2.083) or for 4 and 6 days (2.673). On the contrary, the distance between the model calculated on fresh samples (on day 0) and the other samples increased progressively with the duration of storage. The 87% of fresh samples (day 0) was correctly assigned to the corresponding class, while no sample was attributed to a wrong class. Only 43% of sea bass stored for 1 and 2 days was correctly assigned, showing the difficulty of distinguishing among samples with very similar conservation (1 and 2 days vs. 4 and 6 days). For fillets analysed after 4 days, 53% of them was successfully assigned, while the remaining 47% was also attributed to one of the close classes of storage. At last, only 33% of long-stored samples (6-8 days) was assigned correctly, while 53% was given to two classes. When grouping again fillets into to further classes, fresh fish (days 0, 1 and 2) and stored fish (days 4, 6 and 8), the distance between the two model was less than 3 (2.575). However the percentage of correctly-classified samples was rather high and equal to 71% of samples, while 18% of them was attributed erroneously. Also freeze-dried fillets of sea bass belonging to the sampling no. 4 were analysed at NIRS and their spectra submitted to PCA to evaluate the storage duration (3-17 days). The score plot of PCA did not permit to find any cluster. Therefore, also SIMCA did not give models to be used for sample classification. The limited variability of NIRS spectra in this last sampling, compared to the previous, according to the days of storage could be explained by different reasons: whole fish stored in ice (sampling no. 4) maintained better its freshness compared to a storage at air (sampling no. 3) and showed a minor chemical degradation; freeze-drying of samples submitted to NIRS analysis could have standardized texture and chemical characteristics of samples and therefore reduced information contained in the NIR spectra; first NIRS analysis were made only after 3 days of storage, whereas basing on results obtained on sea bass spectra of sampling no. 3, the best discriminations were made between just caught fresh samples (day 0) and other fishes. Results by NIRS were quite satisfactory also for differentiating samples according to the rearing system. PCA on both fresh minced and freeze-dried fillets (sampling no. 4) showed clusters of samples according to the rearing system with a clear separation of intensively-reared sea bass (I) from those of extensive systems, while spectra of sea bass from sea cages (G) were more distributed and sometimes overlapping the extensive cluster (E). Differently, PCA analysis of spectra from sampling no. 2 separated extensively-reared sea bass (E) from those of intensive systems (I and G). Moreover, model to model distance in SIMCA was always higher than 3 for extensively-reared sea bass in comparison with sea bass from intensive systems or sea cages -(17.3 and 12.9, respectively). The distance between the model of intensively-reared sea bass and sea bass from sea cages (2.3) was not sufficient for a suitable classification and separation. On the whole, 60% of sea bass was correctly assigned to the corresponding cluster (rearing system), 13% of them was attributed to two clusters and 21% of spectra was not assigned at all. Only 6% of spectra was attributed to a wrong class. Within rearing system, the major power of classification was measured for extensively-reared sea bass, while the lowest result was obtained with sea bass from sea cages. Conclusions The results obtained in the frame of the present PhD thesis confirm the high nutritional value of sea bass coming from national farms, which show a good protein level (19%) and fat and energy levels which raise with the intensity of rearing techniques (extensive < semi-intensive and sea cages < intensive on land). The average value and the fatty acid profile of fat contained in sea bass fillets put this species among medium-fat fish, with a high PUFA concentration and a favourable ω-3 to ω-6 ratio. With regards to human health and food safety, sea bass of national farms were safe with a concentration in PCB and heavy metals always lower than law limits. Among the different productive systems, the final fish contamination depended more on environmental pollution than on contamination of commercial diets, when administered. The study of the freshness evolution in sea bass showed a good resistance to degradation, when manipulated with attention and stored with ice, as well as a slower freshness impairment in sea bass from extensive systems compared to those from the other production systems. Because of all these qualitative traits, a key role of the rearing system, rather than of the animal size, was evidenced, sustaining the need of a qualitative characterization and the development of indexes, criteria and innovative and quick analytical techniques, like NIRS, to develop systems of traceability, certification and identification of origin, which are indispensable to guide the consumer’s choices and meet his preference, with the final aim of increasing the competitiveness of the this sector at national and international markets.

La tesi di dottorato è suddivisa in quattro sezioni principali: introduzione, obiettivi, materiali e metodi, risultati e discussione e si conclude con alcune considerazioni generali e l’elenco bibliografico. Introduzione In questa sezione sono riportate le statistiche mondiali e nazionali del settore della pesca e dell’acquacoltura, con particolare riguardo alla produzione della spigola. Sono descritte le caratteristiche morfologiche e l’habitat naturale della spigola, i sistemi di allevamento, in particolare le tecniche di riproduzione e svezzamento, le strutture e i sistemi di ingrasso. La seconda parte del capitolo è dedicata a definire e tracciare lo stato dell’arte sugli aspetti più specifici oggetto di studio in questa tesi, ossia la caratterizzazione qualitativa, morfologica e nutrizionale dei prodotti ittici e della spigola in particolare, la sicurezza alimentare, con il problema della contaminazione da PCB e metalli pesanti, la caratterizzazione e l’evoluzione della freschezza, e, infine, vengono descritte la tecnica della spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS, Near Infrared Reflectance Spectroscopy) e le sue potenziali applicazioni, soprattutto nella qualificazione dei prodotti ittici. La spigola, insieme con l’orata, rappresenta la principale specie ittica allevata in Italia dopo la trota. La forte competizione esistente tra i Paesi produttori dell’area mediterranea (in particolare Turchia, Grecia, Spagna, Croazia) e la conseguente pressione sui prezzi di mercato richiedono una caratterizzazione e una differenziazione della qualità e della sicurezza alimentari del prodotto nazionale. Sebbene con una percezione diversificata da paese a paese è aumentata nel consumatore medio europeo l’attenzione verso la sicurezza delle derrate alimentari, in particolare la preoccupazione per la possibile presenza di sostanze tossiche inorganiche e organiche persistenti nei prodotti ittici dell’acquacoltura. Se da un lato ai prodotti della pesca e dell’acquacoltura è riconosciuta unanimemente una valenza dietetica superiore a quella dei prodotti di animali terrestri, dovuta all’elevata concentrazione di acidi grassi polinsaturi, in particolare della serie ω-3, dall’altro i prodotti ittici sono più suscettibili all’accumulo di contaminanti che si concentrano lungo la catena trofica naturale o si incontrano nei mangimi commerciali. Il controllo della concentrazione di policlorobifenili (PCB) e metalli pesanti riveste un’importanza basilare, trattandosi di inquinanti che si accumulano nei tessuti degli organismi carnivori all’apice della catena trofica e il cui effetto, sebbene controverso, viene associato a varie malattie metaboliche, endocrine e riproduttive e all’insorgenza di tumori. Nella fase post-mortem, la qualità dei prodotti ittici non può prescindere dal grado di freschezza e dallo stato di conservazione. Queste caratteristiche possono essere valutate con diversi metodi basati sulla determinazione in laboratorio della concentrazione di prodotti di degradazione, così come su valutazioni sensoriali eseguite con metodiche standard e non specifiche (Reg. EC 2406/96) o secondo schemi più recenti e adattati alla singola specie e tipologia di prodotto (Quality Index Method, QIM). Tra le metodologie innovative, la l’analisi NIRS può essere utilizzata vantaggiosamente per la caratterizzazione globale dei prodotti ittici freschi e conservati. Già ampiamente utilizzata per la valutazione delle caratteristiche nutrizionali di alimenti zootecnici, per la caratterizzazione, autenticazione dell’origine e per l’individuazione di eventuali adulterazioni in un’ampia gamma di prodotti agro-alimentari, l’analisi NIRS è stata impiegata con successo anche nel settore dell’acquacoltura per predire la composizione chimica di carni di varie specie, oltre che identificare i pesci in funzione del sistema di allevamento e della freschezza. Obiettivi Con l’obiettivo generale di contribuire a rinforzare i programmi per la qualità totale, la sicurezza alimentare e la valorizzazione della spigola attraverso uno studio ad ampio raggio delle caratteristiche biometriche, chimico-nutrizionali, sensoriali e tossicologiche di pesci di diversa taglia commerciale, provenienti da diverse tipologie di allevamento e da diverse aree geografiche del territorio nazionale, la presente tesi ha sviluppato i seguenti obiettivi specifici: Obiettivo 1 - QUALITÀ. Caratterizzare dal punto di vista morfologico, chimico e dietetico spigole provenienti da allevamenti italiani con differenti sistemi produttivi. Obiettivo 2 - CONTAMINANTI. Determinare la presenza e il livello di contaminanti ambientali (PCB e metalli pesanti) in spigole provenienti da differenti sistemi di allevamento italiani. Obiettivo 3 - FRESCHEZZA. Valutare l’evoluzione della freschezza in spigole d’allevamento in funzione del tempo di conservazione e del sistema produttivo. Obiettivo 4 - NIRS. Utilizzare l’analisi NIRS per la caratterizzazione chimica e dietetica, la valutazione della freschezza e l’identificazione di origine di spigole provenienti da diversi sistemi di allevamento. Materiali e Metodi Campionamenti Sono stati utilizzati quattro set di campioni prelevati e analizzati in tempi diversi: Campionamento n. 1: 133 spigole provenienti da 4 impianti con diverso sistema di allevamento (estensivo in valle, semi-intensivo a terra, intensivo a terra, intensivo in gabbie a mare). Campionamento n. 2: 170 spigole di due taglie commerciali (400-600 g e 700-1000 g) prelevate da 11 impianti distribuiti sul territorio nazionale appartenenti a tre sistemi di allevamento (estensivo in valle, intensivo a terra, intensivo in gabbie a mare). Ove utilizzato e disponibile, è stato campionato il mangime somministrato alle spigole nell’ultima fase di allevamento prima della cattura. Campionamento n. 3: 90 spigole (peso medio circa 300 g) prelevate in una fase successiva dall’allevamento semi-intensivo già interessato al campionamento n. 1. Campionamento n. 4: 90 spigole da tre impianti appartenenti a tre diversi sistemi di allevamento (estensivo in valle, intensivo a terra, intensivo in gabbie a mare), già interessati dal campionamento 2. Preparazione dei campioni e analisi I pesci catturati e sacrificati in acqua e ghiaccio sono stati sottoposti a: • valutazione sensoriale della freschezza con l’utilizzo dello schema standard di valutazione UE (Reg. EC 2406/96) e due diversi schemi QIM (Quality Index Method); • biometrie e indici morfometrici; sono stati misurati lunghezza totale, lunghezza standard, altezza massima e lunghezza della testa. Tali misure sono state utilizzate per calcolare fattore di condizione (FC), profilo relativo (PR) e indice craniale (IC); • determinazione del colore (L*a*b*) della pelle in tre punti dorsali e due ventrali mediante spettrofotometro; • analisi della tessitura del pesce intero: è stata eseguita l’analisi del profilo della tessitura (Texture Profile Analysis, TPA) mediante dinamometro; • determinazione del pH oculare; • eviscerazione e pesatura degli organi interni: sono stati separati e pesati pacchetto viscerale, fegato, grasso periviscerale, gonadi, carcassa eviscerata, i singoli filetti con pelle e lo scarto, e calcolati indice epatosomatico, indice viscerosomatico, indice grasso mesenterico, indice gonadico, resa eviscerato, resa in filetti; • determinazione del colore del filetto in tre punti dell’area dorsale, come sopra riportato per il colore della pelle; • determinazione del pH del filetto in tre punti dell’area dorsale; • analisi della tessitura del filetto, mediante analisi TPA; • analisi NIRS del filetto fresco senza pelle e dopo macinazione con spettrometro monocromatore nell’intervallo di lunghezze d’onda fra 1100 e 2500 nm; • analisi del profilo acidico del grasso muscolare mediante gas-cromatografo, previa estrazione dei lipidi; • analisi dell’azoto basico volatile totale (TVBN) del campione di filetto macinato fresco; • liofilizzazione del filetto; • analisi NIRS del filetto liofilizzato, come per i filetti macinati freschi; • determinazione delle caratteristiche chimiche (umidità, lipidi, proteina, ceneri) e del contenuto di energia lorda sul filetto liofilizzato; • determinazione della concentrazione di metalli pesanti del filetto e dei mangimi con ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) previa mineralizzazione; • determinazione della concentrazione di PCB del filetto e dei mangimi. Per le spigole raccolte del campionamento n. 1, è stata determinata la concentrazione di 12 congeneri rappresentativi della contaminazione di PCB, tra cui i 7 congeneri indicatori (28, 52, 101, 118, 138, 153 e 180). Su 18 pool di spigole e su 7 mangimi provenienti dal campionamento n. 2, i PCB sono stati misurati come concentrazione e sommatoria di tossicità equivalente (TEQ) dei 12 congeneri di PCB diossina-simili. Trattamento dei dati e analisi statistica Obiettivo 1 - Qualità: i dati biometrici e gli indici morfometrici (campionamenti n. 2, 3 e 4) e i dati analitici (campionamenti n. 1, 2, 3 e 4) sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA) mediante procedura GLM del SAS, considerando come fattori di variazione il sistema di allevamento e la taglia degli animali. Obiettivo 2- Contaminanti: i dati relativi al contenuto di metalli pesanti e di PCB sono stati sottoposti ad analisi della varianza, considerando come fattore di variabilità l’allevamento di origine (campionamento n 1 e 2). Per il campionamento n. 2, il peso vivo degli animali al momento della macellazione è stato incluso nel modello come covariata. Inoltre, sono stati calcolati i coefficienti di correlazione e le regressioni fra peso vivo degli animali e contenuto di estratto etereo; peso vivo degli animali e contenuto di PCB (ng/g di grasso); contenuto di estratto etereo e livello di PCB (ng/g di grasso). Obiettivo 3 - Freschezza: i dati morfometrici e analitici sono stati sottoposti ad analisi della varianza considerando come fattori di variazione la durata della conservazione (campionamenti n. 3 e 4) e l’allevamento di origine (campionamento n. 4). I risultati della valutazione sensoriale sono stati analizzati con Proc UNIVARIATE del SAS. Le variabili con distribuzione normale sono state sottoposte ad analisi della varianza con procedura GLM; quelle con distribuzione non normale ad analisi della varianza non parametrica (test di Kruskal-Wallis e Mann-Whitney) con procedura NPAR1WAY. Obiettivo 4 - NIRS: gli spettri sono stati acquisiti come dati in riflettanza, trasformati in assorbanza e in derivata seconda (2, 20, 20). Le calibrazioni per la predizione della composizione chimica del filetto e di alcune caratteristiche della carcassa sono state calcolate con Partial Least Square Regression (PLSR) sui dati trasformati in derivata seconda e validate utilizzando la full cross-validation. La Principal Component Analysis (PCA) e la Soft Independent Modelling Class Analogy (SIMCA) sono state utilizzate per la discriminazione e classificazione dei campioni in funzione dell’origine (campionamenti n. 2 e 4) e del tempo di conservazione (campionamenti n. 3 e 4). Risultati Obiettivo 1 - Qualità Il sistema di allevamento ha significativamente modificato le caratteristiche morfologiche, biometriche e reologiche, oltre che la composizione chimica. Nel campionamento n. 2, la resa in carcassa eviscerata è stata significativamente maggiore (P<0,05) nelle spigole provenienti da allevamenti estensivi (87,7%) in valle rispetto a quelle allevate intensivamente in gabbie a mare (85,9% in media) e simile a quella delle spigole allevate intensivamente a terra (87,0%). La resa in filetti è invece risultata inferiore nelle spigole di allevamento estensivo rispetto a quelle di altri sistemi (46,1 vs. 48,5%). Infine, l’indice del grasso mesenterico è risultato minore nei soggetti allevati in gabbie piuttosto che in sistemi estensivi e intensivi a terra (2,21 vs. 3,40 e 4,24%, rispettivamente; P<0,05). Nel campionamento n. 4, le differenze fra i sistemi sono risultate accentuate. In entrambi i campionamenti, l’intensità e la saturazione delle tonalità di rosso e giallo misurate sulle spigole sono risultate più marcate nelle spigole di allevamenti estensivi, rispetto a quelle di allevamenti intensivi a terra e, in maniera ancora più evidente, in quelle provenienti da allevamenti in mare (P<0,05). Ulteriori differenze sono state evidenziate nelle caratteristiche di tessitura del pesce intero (campionamento n. 4), laddove la forza massima esercitata per la prima compressione del campione è risultata significativamente maggiore per le spigole di allevamento estensivo e di gabbia e minore per quelle di allevamento intensivo a terra (29,2 e 26,7 vs. 21,8 N; P<0,001) ad indicare una maggiore consistenza strutturale delle spigole dei primi due gruppi. Il pH del filetto è risultato superiore (P=0,02) nelle spigole di gabbia a mare (6,42) piuttosto che di allevamento estensivo e intensivo a terra (6,29 e 6,28). In tutti i campionamenti (n. 1, 2), i filetti di spigole di allevamento estensivo sono risultati meno grassi (P<0,01) rispetto a quelli dei pesci allevati intensivamente (in vasche a terra e in gabbie a mare). Inoltre, i filetti dei pesci provenienti da allevamenti a terra sono risultati più grassi rispetto a quelli delle spigole allevate in gabbie a mare (P<0,05). Come ovvio, il contenuto energetico dei filetti è aumentato all’aumentare del contenuto lipidico, mentre il contenuto di acqua è diminuito. La taglia delle spigole (small e large; campionamento n. 2 riguardante 11 allevamenti sparsi nel territorio nazionale) ha modificato in modo significativo, ma limitato in valore assoluto, gli indici biometrici di profilo relativo e indice craniale. Le spigole più pesanti hanno evidenziato un fattore di condizione superiore e una maggiore incidenza degli scarti all'eviscerazione (indice epatosomatico) (P<0,001), seppure in assenza di differenze nelle rese in carcassa (P>0,05). La resa in filetti è stata superiore nei pesci di taglia maggiore (48,2 vs. 47,2%; P=0,05). La classe di taglia non ha influenzato gli indici di colore della livrea fatta eccezione per i valori di L* in posizione dorsale (42,6 vs. 39,7; P<0.05), che hanno evidenziato una maggiore luminosità delle spigole di piccola taglia. La composizione chimica non è stata invece influenzata significativamente dalla taglia considerata. Con il campionamento n. 3, che ha interessato spigole provenienti da un unico allevamento semi-intensivo, sono state ottenute anche informazioni sulla variabilità del profilo acidico del grasso delle spigole. Il contenuto in acidi grassi saturi rappresenta il 26,5% del totale e il maggiore rappresentante è l’acido palmitico. Gli acidi grassi monoinsaturi rappresentano il 34,5% del totale, rappresentati per il 50% dall’ac. oleico. Il contenuto in acidi grassi polinsaturi (PUFA) è risultato in media del 34,4%, equamente ripartito fra le serie ω-3 (17,3%) e ω-6 (15,8%). Per la serie ω-6 è risultato predominante l’acido alfa-linoleico, mentre per la serie ω-3 sono risultati predominanti gli acidi eicosapentaenoico e docoesaenoico. Obiettivo 2 - Contaminanti Il sistema di allevamento ha significativamente influenzato la concentrazione totale dei 12 PCB più frequenti (PCBtot) e dei 7 PCB indicatori (PCB7) nelle spigole del campionamento n. 1, che è risultata minore nelle spigole di allevamento estensivo (112,0 e 74,6 ng/g grasso, rispettivamente) rispetto alle spigole degli altri sistemi di allevamento (in media 179,7 e 123,2 ng/g grasso, rispettivamente) (P<0,001). Quando i valori sono stati espressi per g di muscolo fresco, le concentrazioni di PCBtot e PCB7 sono risultate inferiori nelle spigole di allevamento estensivo (3,412 e 2,266 ng/g peso fresco, rispettivamente), intermedie nei pesci degli stagni semi-intensivi (15,398 e 10,632) e delle gabbie a mare (13,123 e 8,882), e superiori nei campioni delle vasche di allevamento intensivo (18,176 e 12,440) (P<0,001). Entro allevamento, la concentrazione lipidica del filetto e il peso di macellazione sono risultati correlati positivamente (r=0,79). La concentrazione di PCB7 espressa per g di grasso muscolare è risultata correlata positivamente sia con il peso di macellazione delle spigole (r=0,71) che con la concentrazione lipidica del filetto (r=0,86). La correlazione fra il peso delle spigole e la concentrazione lipidica del filetto è aumentata (r=0,73 e 0,96, rispettivamente) quando la concentrazione di PCB7 è stata espressa per g di peso fresco. La correlazione fra la concentrazione di PCB7 sul peso fresco e il peso dei pesci è stata influenzata dal sistema di allevamento, mentre la correlazione dei PCB7 e la concentrazione lipidica del filetto non è stata influenzata dal sistema di allevamento. Il contenuto totale dei 12 PCB diossina-simili nei mangimi ottenuti dal campionamento n. 2 (relativi all’ultimo periodo di allevamento) è risultato maggiore negli allevamenti con gabbie in mare G1 (29,35 ng/g grasso) e G3 (15,80 ng/g grasso) seguiti dagli allevamenti intensivi I1 e I3 (12,72 e 12,62 ng/g grasso rispettivamente), mentre contaminazioni inferiori sono state riscontrate nei mangimi degli altri allevamenti. Nei filetti, in funzione del sistema di allevamento, è significativamente variato (P<0,05) il contenuto di PCB dei soli congeneri n. 126 e 189, laddove è proprio la variazione del congenere n. 126, molto tossico, a determinare le maggiori ricadute sulla tossicità dei prodotti. Il valore maggiore di equivalenti di tossicità (TEQ) è stato infatti misurato per il PCB n. 126 nei filetti di spigole da allevamenti estensivi (19,7 pg/g grasso; P=0,05) piuttosto che in quelli di pesci da sistemi intensivi (7,58 pg) o da gabbie a mare (11,0 pg). Di conseguenza, la sommatoria di equivalenti di tossicità (ΣTEQ), espressa per g di grasso, è variata significativamente (P=0,05) in funzione del sistema di allevamento, con il valore maggiore per i sistemi estensivi rispetto a quelli intensivi a terra e in gabbie marine (21,9 vs. 8,89 e 12,6 pg/g grasso, rispettivamente). Esprimendo i dati sul peso del campione fresco, tuttavia, la ΣTEQ è variata in modo non significativo fra i sistemi di allevamento (da 0,72 a 0,83 pg/g di peso fresco). Non sono state osservate differenze significative nella concentrazione di PCB diossina simili e nella ΣTEQ, espressi sia sul contenuto lipidico che sul peso fresco, in funzione della taglia degli animali campionati. Nelle spigole provenienti dal campionamento n. 1, la concentrazione dei PCB7 (75-131 ng/g grasso) è risultata sempre inferiore al limite (200 ng/g grasso) stabilito nel 1999 dalla legislazione dell’Unione Europea per la carne suina e avicola fresca e i prodotti derivati destinati al consumo umano. Una recente normativa (2006) sancisce invece per i pesci e i prodotti ittici un contenuto massimo accettabile di diossine e furani pari a 4,0 pg TEQ/g di peso fresco e la somma di diossine, furani e PCB diossina-simili pari a 8,0 pg TEQ/g di peso fresco. Nei filetti provenienti dal campionamento n. 2, anche il valore più elevato di concentrazione di PCB diossina-simili riscontrato in un allevamento estensivo (TEQ 45,3 pg/g grasso, corrispondenti a 0,735 pg/g peso fresco) è risultato largamente inferiore ai limiti di legge. Per i metalli pesanti, sono state evidenziate notevoli variazioni nella presenza dei singoli elementi nei mangimi in funzione dell’allevamento considerato: la concentrazione dell’arsenico è risultata superiore negli allevamenti G1 e I2 e inferiore negli allevamenti E3, I1, I3, G3 e G4. La concentrazione degli altri metalli è risultata meno variabile tra i diversi mangimi. In nessuno dei campioni analizzati, è stato possibile rilevare presenza di mercurio, mentre zinco e rame sono risultati più abbondanti, anche in relazione alla probabile integrazione effettuata negli stessi mangimi. Nei filetti, laddove determinabile, il mercurio è stato rilevato a livelli compresi tra 0,023 e 0,152 mg/kg s.s., con i valori maggiori negli allevamenti estensivi, sebbene a livelli nettamente inferiori ai 0,5 mg/kg peso fresco fissati dalla normativa UE. L’arsenico è stato rilevato in concentrazioni elevate (12-15 mg/kg s.s.) nei filetti di uno degli allevamenti estensivi, mentre in tutti gli altri allevamenti i valori sono risultati compresi tra 1 e 3 mg/kg s.s. e anche inferiori a 1 mg/kg s.s. La concentrazione di rame nelle spigole provenienti da allevamenti estensivi è risultata inferiore rispetto agli allevamenti intensivi a terra o in gabbia (0,82 vs. 1,03 e 1,06 mg/kg peso fresco; P<0,01). La concentrazione di piombo nei filetti, seppure non diversa significativamente tra sistemi di allevamento, è risultata superiore nell’allevamento intensivo (0,13 mg/kg peso fresco). In due dei quattro allevamenti intensivi, tale concentrazione è risultata superiore (0,22 e 0,30 mg/kg peso fresco) ai suddetti limiti, fissati in 0,20 mg/kg di muscolo fresco dal Regolamento EC 466/2001 (modificato dal Reg. EC 78/2005). Anche l’arsenico è stato dosato a livelli 3-4 volte superiori nei pesci allevati con sistema estensivo rispetto all’intensivo a terra e in gabbia, seppure con livelli di probabilità statistica non significativi (P=0,12). Nessuna differenza di concentrazione dei metalli pesanti è stata individuata in funzione della taglia del pesce. Obiettivo 3 - Freschezza La valutazione dell’evoluzione della freschezza e del sistema di allevamento è stata effettuata su due gruppi di spigole provenienti dal campionamento n. 3, dove è stato valutato l’effetto del tempo di conservazione, e dal campionamento n. 4 dove è stato valutato sia l’effetto del tempo di conservazione che del sistema di allevamento. Con il campionamento n. 3 sono state prelevate 90 spigole provenienti da un unico allevamento semi-intensivo e conservate in gruppi di 15 esemplari per 0, 1, 2, 4, 6 e 8 giorni in cassette senza ghiaccio e in cella frigorifera a 2°C. I rilievi biometrici e le caratteristiche della carcassa sono variate poco durante la conservazione. Alla valutazione sensoriale, 8 giorni dopo la macellazione, le spigole presentavano ancora un grado di freschezza accettabile, anche se alcuni tratti (brillantezza, muco, durezza per l’aspetto generale; odore e muco delle branchie) hanno evidenziato una degradazione più rapida rispetto ad altri caratteri. Le caratteristiche dell’occhio sono rimaste invariate e lo scolorimento dell’addome limitato, mentre la compattezza dell’addome e l’odore della cloaca hanno presentato una degradazione intermedia. La regressione fra i punteggi QIM nel periodo da 0 a 8 giorni di conservazione è stata spiegata da un elevato coefficiente di determinazione (R2=0,95), con un’evoluzione lineare (aumento con il tempo di conservazione) e quadratica (rallentamento dell’incremento di valore col tempo di conservazione). Tra le misure reologiche di freschezza, il pH oculare è diminuito da 7,25 al giorno 0 a 7,04 al giorno 4 per aumentare a 7,48 a 8 giorni di conservazione (componenti lineare e quadratica della varianza, P<0,001), mentre il pH del filetto non è stato modificato. Durante la conservazione, la luminosità della livrea è aumentata linearmente all’aumentare del numero di giorni da 44,8 a 52,3, con il valore maggiore misurato dopo 2 giorni di conservazione; l’indice del rosso si è spostato da valori positivi vicini allo zero verso valori minori e tendenti al verde; la riduzione dell’indice b* ha evidenziato una corrispondente diminuzione della colorazione gialla (da 5,63 a 2,42) con un andamento di tipo quadratico (Q=0,02). Per quanto attiene il colore del filetto, la luminosità è aumentata con i giorni di conservazione (L<0,001 e Q<0,01). Gli indici di colore a* e b* sono invece aumentati ai giorni 1 e 2 per poi diminuire significativamente dopo 6-8 giorni di conservazione (L<0,01; Q<0,05). La struttura del filetto è variata significativamente: la durezza è aumentata dalla macellazione (4,86 N al giorno 0) al giorno 4 di conservazione (7,20 N) per poi diminuire ai giorni 6 e 8 (L<0,001; Q=0,02) seguendo l’instaurarsi e la risoluzione del rigor mortis. Il valore di elasticità è linearmente diminuito (L=0,09), anche se i valori più bassi sono stati misurati 1 e 2 giorni dopo la macellazione (Q<0,01). In quanto alla composizione chimica, nel corso della conservazione, la concentrazione di azoto basico volatile totale è aumentata (da 15,6 a 16,5 mg/100 g; L<0,001). Per quanto riguarda il profilo acidico del grasso muscolare, la concentrazione di acido palmitico è diminuita linearmente dal 17,8 al 17,1% all’aumentare del tempo di conservazione, mentre la variazione a carico dell’acido stearico, sebbene significativa, è apparsa limitata in termini assoluti per la sua bassa percentuale (inferiore allo 0,5%). Non è variata la concentrazione di acidi grassi monoinsaturi, mentre, fra gli acidi grassi polinsaturi della serie ω-6, la concentrazione di acido alfa-linoleico è risultata superiore dopo 8 giorni di conservazione. L’acido arachidonico, comunque poco rappresentato, è significativamente diminuito durante la conservazione. Fra gli acidi grassi della serie ω-3, l’acido linolenico è aumentato linearmente (da 2,04 a 2,23%), mentre EPA e, soprattutto, DHA sono significativamente diminuiti con i giorni di conservazione. L’esame di altre 90 spigole (campionamento n. 4) provenienti da 3 allevamenti (estensivo, intensivo a terra e intensivo in gabbie marine) e conservate per 3, 6, 10, 13 e 17 giorni in cassette coperte di ghiaccio e mantenute in cella frigorifera a 2°C ha confermato l’assenza di un effetto del tempo di conservazione sulle misure biometriche e le rese in carcassa e filetto. La valutazione sensoriale ha confermato l’aumento significativo del punteggio QIM e una correlazione sempre elevata (R2 da 0,84 a 0,95 a seconda dell’allevamento considerato) con i giorni di conservazione. L’evoluzione del QIM ha però evidenziato un andamento curvilineo, con una degradazione della freschezza più rapida nei primi giorni, quindi rallentata fino a 10-13 giorni di conservazione (QIM normalizzato pari al 30-35% della perdita completa di freschezza) e infine accelerata tra 13 e 17 giorni di conservazione quando il livello di degradazione ha raggiunto il 65-70%. La perdita completa dello stato di freschezza nelle condizione di conservazione utilizzate è stata stimata attorno a 20-21 giorni. L’andamento curvilineo del punteggio QIM va attribuito alla diversa velocità di degradazione delle diverse caratteristiche sensoriali analizzate: l’aspetto della pelle e la consistenza delle spigole già dopo 3 giorni di conservazione hanno presentato una discreta degradazione, così come le caratteristiche delle branchie (odore e colore). Al contrario, le caratteristiche dell’occhio (cornea, pupilla, forma) e quelle dell’addome (colore e aspetto sfintere anale) sono risultate più stabili e peggiorate in maniera apprezzabile solo a partire dai 13 giorni di conservazione. Durante la conservazione, la colorazione della livrea e la struttura del pesce hanno mostrato un’evoluzione simile a quanto descritto per le spigole del campionamento n. 3: la durezza misurata sul pesce intero è progressivamente diminuita dal giorno 3 di conservazione al giorno 17 (da 28,9 a 23,4 N; P<0,01) seguendo la risoluzione del rigor. Il pH del filetto è rimasto stabile fino a 13 giorni (6,30 circa) per poi aumentare a 6,45 (P=0,10) al 17° giorno. In quanto al sistema di allevamento, i pesci provenienti dall’allevamento estensivo hanno evidenziato alla valutazione sensoriale una degradazione più lenta rispetto a quelli dell’allevamento intensivo e, soprattutto, delle gabbie (P<0,001), mentre non sono state misurate differenze significative per le altre variabili. Nei pesci provenienti dalle gabbie, a parità di tempo di conservazione, l’aspetto della pelle, la consistenza del pesce e le caratteristiche dell’occhio sono risultati più degradati rispetto agli altri allevamenti, mentre le altre caratteristiche sensoriali sono risultate più stabili nel tempo. Le spigole di allevamento intensivo hanno ricevuto la classificazione migliore per quanto attiene la presenza di emorragie (P<0,10), il che lascia supporre una diversa gestione dei pesci prima e durante la macellazione nei diversi allevamenti campionati. Obiettivo 4 - NIRS La predizione NIRS della composizione chimica dei filetti di spigola è risultata adeguata e soddisfacente sia sui campioni macinati freschi (campionamento n. 3) che liofilizzati (campionamento n. 2) con coefficienti di determinazione in validazione (R2v) elevati per contenuto di acqua (0,95-0,97), estratto etereo (0,96-0,98) ed energia lorda (0,94-0,95). La predizione del contenuto di proteina grezza ha evidenziato in entrambi i campionamenti un grado di correlazione (R2v=0,72-0,73) fra dato spettrale e contenuto nel campione minore rispetto agli altri costituenti chimici, seppure buono in valore assoluto. L’errore di predizione in validazione (SECV) per i diversi costituenti chimici è risultato diverso in funzione della variabilità dei dati nel set di campioni considerato, ma sempre tale da dare un’accuratezza di predizione buona (acqua, estratto etereo, energia) o comunque accettabile (proteina grezza). La predizione NIRS della percentuale di acidi grassi dei lipidi muscolari realizzata sugli spettri dei filetti macinati freschi (campionamento n. 3) non ha fornito risultati molto incoraggianti. Solo per poche variabili, le calibrazioni hanno prodotto un coefficiente di correlazione in calibrazione superiore a 0,50 (acido palmitico, acidi grassi saturi, acido alfa-linoleico, acido docoesaenoico) e comunque con un elevato SECV. Nel set di calibrazione delle spigole provenienti dal campionamento n. 2 (11 allevamenti di diversa tipologia), l’analisi NIRS è stata estesa anche alla predizione di alcune variabili legate alla morfologia dell’animale e alle caratteristiche della carcassa. La predizione NIRS del fattore di condizione è stata realizzata con successo e con un limitato errore (R2cv=0,79, SECV=0,09); quella per il peso di macellazione e la resa in filetti è risultata accettabile (R2cv=0,48-0,55), mentre la predizione della resa in carcassa è stata debole. L’analisi NIRS dei filetti macinati delle spigole conservate per 8 giorni (campionamento n. 3) ha evidenziato una buona correlazione fra dati spettrali e durata della conservazione espressa in giorni (R2cv=0,95; SECV=0,89 giorni). Il raggruppamento dei campioni più freschi (ai giorni 0, 1 e 2) e di quelli sottoposti a una maggiore conservazione (4, 6 e 8 giorni) ha migliorato, riducendolo, l’errore di predizione (0,75 giorni). Utilizzando la SIMCA, è stata misurata una distanza fra modelli insufficiente per la discriminazione fra i campioni conservati per 1 vs. 2 giorni (2,083) e fra i campioni conservati per 4 vs. 6 giorni (2,673). Viceversa, la distanza fra il modello calcolato sui campioni freschi (al giorno 0) e gli altri campioni è aumentata progressivamente con la durata della conservazione. I campioni al giorno 0 sono stati classificati correttamente per l’87% e nessun campione è stato assegnato ad una classe errata. Nel caso dei campioni conservati per 1 o 2 giorni, solo il 43% delle spigole è stato classificato correttamente, evidenziando la difficoltà del metodo di distinguere in modo efficace fra campioni conservati per tempi vicini (1 e 2 giorni vs. 4 e 6 giorni). Nel caso dei filetti analizzati dopo 4 giorni, il 53% dei campioni è stato assegnato correttamente, mentre il 47% degli stessi è stato assegnato anche ad una delle classi adiacenti. Per il 33% dei campioni più vecchi (6-8 giorni), infine, l’assegnazione è stata corretta, mentre il 53% è stato assegnato a entrambe le classi. A un nuovo raggruppamento dei campioni in due classi, pesce fresco (giorni 0, 1 e 2) e pesce conservato più a lungo (giorni 4, 6 e 8), la distanza fra i due modelli è risultata inferiore a 3 (2,575). Tuttavia la percentuale di campioni classificati correttamente nella classe corrispondente è stata elevata e pari in media a 71% dei campioni, mentre il 18% ha ricevuto una classificazione errata. Anche i filetti liofilizzati delle spigole provenienti dal campionamento n. 4 sono stati sottoposti ad analisi NIRS e gli spettri analizzati con PCA per valutare la durata della conservazione (3-17 giorni). Lo score plot della PCA non ha permesso l’identificazione di alcun cluster. Pertanto, anche l’analisi SIMCA non ha prodotto modelli utili per la classificazione dei campioni. La scarsa variabilità degli spettri NIRS delle spigole di questo campionamento, rispetto al precedente, in funzione dei giorni di conservazione potrebbe essere spiegata con le seguenti argomentazioni: il pesce intero stoccato in ghiaccio (campionamento n. 4) è stato conservato meglio rispetto al pesce in cassetta all’aria (campionamento n. 3) e ha manifestato una minore degradazione chimica; la liofilizzazione del campione sottoposto ad analisi NIRS potrebbe aver uniformato le caratteristiche strutturali e chimiche del campione e quindi ridotto le informazioni contenute nello spettro NIR; le prime analisi di freschezza sono state realizzate dopo 3 giorni di conservazione, laddove, sulla base dei risultati ottenuti sugli spettri delle spigole provenienti dal campionamento n. 3, le migliori discriminazioni erano state fatte rispetto ai campioni freschi e appena pescati (giorno 0). L’analisi NIRS è stata utilizzata con un discreto successo anche per la discriminazione dei campioni in funzione del sistema di allevamento. La PCA sugli spettri delle spigole sia macinate fresche che liofilizzate (campionamento n. 4) ha evidenziato il raggruppamento dei campioni in funzione del sistema di allevamento con una separazione delle spigole di allevamento intensivo (I) rispetto a quelle di allevamento estensivo, mentre gli spettri delle spigole pescate da gabbie (G) hanno mostrato una distribuzione più dispersa e sovrapposta al gruppo estensivo (E). L’analisi PCA degli spettri dei filetti liofilizzati delle spigole del campionamento n. 2 ha invece evidenziato la separazione delle spigole allevate con sistemi estensivi (E) rispetto a quelle provenienti da sistemi intensivi (I e G). Inoltre, la distanza misurata nell’analisi SIMCA fra i modelli PCA relativi alle spigole di sistema estensivo rispetto a quelli di sistemi intensivi e gabbie a mare è risultata sempre superiore a 3 (17,3 e 12,9, rispettivamente), evidenziando così la buona capacità di classificazione dell’analisi NIRS. La distanza dei modelli per le spigole di allevamento intensivo e quelle provenienti da gabbie a mare (2,3) non è invece risultata sufficiente per un’adeguata separazione dei campioni. Nel loro insieme, le spigole sono state correttamente attribuite al relativo cluster (sistema di allevamento) nel 60% dei casi, mentre il 13% è stato attribuito a 2 cluster e il 21% non è stato assegnato a nessun cluster. Solo il 6% dei campioni è stato però assegnato ad una classe errata. All’interno della tipologia di allevamento, il maggior grado di precisione nell’attribuzione al cluster corrispondente ha riguardato i campioni provenienti dagli allevamenti estensivi, mentre le spigole provenienti dalle gabbie a mare sono state classificate correttamente con minor frequenza. Conclusioni I risultati ottenuti con le sperimentazioni oggetto di questa tesi di dottorato ribadiscono nel complesso l’eccellente valore dietetico delle spigole provenienti dagli allevamenti nazionali campionati, caratterizzato da un buon livello proteico (19%) e livelli lipidici e calorici crescenti con l’intensità produttiva (estensivo < semi-intensivo e gabbie a mare < intensivo a terra). Il livello medio e il profilo acidico dei lipidi misurati nelle carni di spigola permette di classificare questa specie nella categoria dei pesci semi-grassi, con un contenuto elevato di acidi grassi polinsaturi a favorevole rapporto ω-3/ω-6. Con riferimento alla salute umana e alla sicurezza alimentare, le spigole di allevamenti nazionali sono risultate prodotti sicuri con una concentrazione di PCB e metalli pesanti sempre inferiore ai limiti di legge. Fra i diversi sistemi produttivi, la contaminazione finale del pesce è risultata più dipendente dalla contaminazione ambientale piuttosto che dalla contaminazione dei mangimi eventualmente somministrati. Lo studio dell’evoluzione del grado di freschezza della spigola ha evidenziato una buona resistenza della specie alla degradazione, qualora manipolata con cura e conservata in ghiaccio, e ritmi di degradazione più lenti nel caso di spigole derivate dall’allevamento estensivo. Per tutti questi aspetti qualitativi, è stato evidenziato un ruolo importante del sistema di allevamento piuttosto che della taglia, rinforzando la necessità di una caratterizzazione qualitativa e dello sviluppo di indici, criteri e tecniche analitiche innovative e rapide quale quella NIRS utili allo sviluppo di sistemi di tracciabilità, certificazione e identificazione di origine, strumenti questi indispensabili per orientare le scelte di consumo e incontrare le preferenze del consumatore, al fine di accrescere la competitività del settore sui mercati nazionali e internazionali.