NMR and biochemical analysis of protein-protein interactions: insights on dopamine synthesis regulation and heterochromatin formation

Molecular recognition between proteins plays a fundamental role in almost all biological processes. Therefore, the structural characterization of protein-protein interactions represents a fundamental tool to shed light on the molecular mechanisms of biological events. Moreover, it can elucidate the structural basis of the function for proteins without a detectable catalytic activity. The regulation of dopamine synthesis is an example of the importance of protein-protein interactions in the modulation of a biological function. L-Dopamine, one of the catecholaminergic neurotransmitters, has many functions in the brain, including regulation of behavior and cognition, motor activity, and sleep. The enzyme responsible for the biosynthesis of its precursor L-DOPA, named Tyrosine Hydroxylase, is therefore tightly regulated by different mechanisms. One of the most important is the interaction with protein modulators. 14-3-3 proteins bind to the N-terminal regulatory domain of Tyrosine Hydroxylase, leading to the stabilization of the active conformer. Several published data suggest that also alpha-synuclein, a natively unfolded protein linked to the pathogenesis of Parkinson Disease, could play a role in dopamine synthesis, through the inhibition of Tyrosine Hydroxylase. Interestingly, experimental evidence exists also for the interaction between 14-3-3 protein and alpha-synuclein: the binding has been supposed to have functional significance in the network regulation of dopamine synthesis. The first part of this research is focused on the characterization of the interactions among these three key protein modulators of dopamine biosynthesis using a combined biochemical and spectroscopic approach. The work can be devided into different levels. Molecular biology, biochemical and spectroscopic methods were used to obtain and characterise each protein sample separately. Subsequently, we analysed the interaction between each pair of protein partners using both biochemical and biophysical tools, in particular NMR spectroscopy. Electrophoretic and chromatographic results revealed that alpha-synuclein and 14-3-3 proteins fail to form a stable complex in solution, while NMR experiments suggest a transient interaction involving only the first N-terminal residues of monomeric alpha-synuclein. However, a strong indication of interaction comes from aggregation experiments followed by fluorescence polarization, where 14-3-3 proteins were demonstrated to slow down the alpha-synuclein aggregation rate. Taken together, these results suggest that 14-3-3 proteins may bind to the alpha-synuclein oligomeric species, thus opening a possible chaperon function of 14-3-3 proteins to prevent alpha-synuclein aggregation and fibrillation. On the other hand, both enzymatic and NMR experiments indicated that alha-synuclein does not inhibit Tyrosine Hydroxylase and there is no direct interaction between the two proteins in the experimental conditions tested. Finally, we verified, using biochemical tools, the formation of a complex with high affinity between 14-3-3 proteins and Tyrosine Hydroxylase phosphorylated in Serine 19, and carried out preliminary crystallization screenings of the complex. Moreover, this research includes the NMR structural investigation of a second example of protein-protein interaction, involved in a different biological function. We analysed the molecular recognition mechanism between Heterochromatin protein 1 (Hp1beta) and a twenty-one residues peptide that mimics the histone 3 N-terminal tail of the nucleosome. The Hp1beta/histone 3 interaction leads to the packaging of the DNA in tertiary and quaternary structures, altogether named heterochromatin. As heterochromatin prevents access of the transcriptional machinery to the DNA, its formation represents a regulatory mechanism to inhibit gene expression in specific regions of the genome. As necessary premise to study this interaction by NMR, we assigned, using heteronuclear 3D experiments, the 1H,15N and 13C backbone chemical shifts of Hp1beta protein. At present, we completed the assignment of the resonances from the domain that mediates the interaction with histone 3, called chromo-domain. The assignment of the signals from the other two parts of the molecule, named hinge region and chromo-shadow domain, is in progress. We then characterised the tumbling of the different parts of Hp1beta protein by cross-correlation experiments. Residual dipolar couplings were used to compare the structure of the chromo-domain domain in the full-length protein with that published for the domain produced as deleted mutant. [1H,15N] HSQC experiments were obtained titrating Hp1beta with the histone 3 derived peptide. The results of the chemical shift perturbation analysis allowed us to map the residues of Hp1beta protein that are responsible for the interaction with the histone 3 N-terminal tail.

Il riconoscimento molecolare tra proteine riveste un ruolo fondamentale nella gran parte dei processi biologici. Pertanto, la caratterizzazione strutturale delle interazioni proteina-proteina rappresenta una chiave di lettura fondamentale per far luce sui meccanismi molecolari alla base dei processi biologici. Inoltre tale caratterizzazione può chiarire le basi strutturali della funzione di quelle proteine che mancano di attività catalitica rilevabile. La regolazione della sintesi di dopamina è un esempio dell'importanza delle interazioni proteina-proteina nella modulazione delle funzioni biologiche. La dopamina, uno dei neurotrasmettitori catecolamminergici, regola molte funzioni del sistema nervoso, tra cui quelle legate al comportamento ed ai processi cognitivi, all’attività motoria e al sonno. L'enzima responsabile della sintesi del suo precursore L-DOPA, è la Tirosina Idrossilasi. Data l’importanza della sua attività catalitica, l’enzima è finemente regolato da molteplici meccanismi. Uno dei più importanti è basato sull’interazione con modulatori proteici. Le proteine 14-3-3 legano il dominio regolatore ammino-terminale della Tirosina Idrossilasi, stabilizzandone la conformazione cataliticamente attiva. Diversi dati pubblicati in letteratura sostengono che anche l’alfa-sinucleina, una proteina “natively unfolded” correlata all’insorgenza del morbo di Parkinson, potrebbe avere una funzione nella sintesi della dopamina, attraverso l'inibizione della Tirosina Idrossilasi. Di particolare interesse sono le evidenze sperimentali che dimostrano l'interazione tra alfa-sinucleina e proteine 14-3-3, che potrebbe giocare un ruolo importante nella complessa rete di regolazione della sintesi della dopamina. La prima parte di questa ricerca è focalizzata sulla caratterizzazione delle interazioni fra i tre modulatori proteici della sintesi della dopamina, attraverso l’utilizzo combinato di tecniche biochimiche e spettroscopiche. Il lavoro si articola in più livelli. Metodi di biologia molecolare, biochimica e spettroscopia sono stati impiegati per produrre e caratterizzare i campioni di proteine per i successivi studi. Abbiamo poi analizzato l'interazione di ciascuna coppia di proteine, utilizzando sia tecniche di biochimica e di biofisica, in particolare spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Dai risultati elettroforetici e cromatografici è emerso che alfa-sinucleina e proteine 14-3-3 non formano un complesso stabile in soluzione, mentre esperimenti NMR suggeriscono che vi sia una interazione debole che coinvolge solo i primi residui della regione ammino-terminale dell' alfa-sinucleina. Tuttavia, esperimenti di aggregazione seguendo il segnale di polarizzazione di fluorescenza, portano ad una forte indicazione dell’interazione tra le due proteine, dimostrando che le proteine 14-3-3 sono in grado di rallentare la velocità di aggregazione dell’alfa-sinucleina. Complessivamente i risultati suggeriscono che le proteine 14-3-3 potrebbero legarsi alle specie oligomeriche dell' alfa-sinucleina, aprendo quindi la strada ad una possibile funzione di “chaperon” nell’ inibizione del processo di aggregazione e fibrillazione dell’ alfa-sinucleina. Invece, sia gli studi di attività enzimatica che NMR, indicano che l’ alfa-sinucleina non è un inibitore della Tirosina Idrossilasi, e che non c’è interazione diretta tra le due proteine nelle condizioni sperimentali utilizzate. Infine, mediante tecniche biochimiche, abbiamo verificato che le proteine 14-3-3 e Tirosina Idrossilasi fosforilata sulla serina 19, formano un complesso ad alta affinità. Abbiamo quindi purificato il complesso su larga scala, ed effettuato lo screening preliminare di cristallizzazione. La seconda parte del lavoro di ricerca si occupa dell’ indagine strutturale, mediante NMR, di un secondo esempio di interazione proteina-proteina che è alla base di una differente funzione biologica. Abbiamo analizzato il meccanismo di riconoscimento molecolare tra “Heterochromatin protein 1” (Hp1beta) ed un peptide di ventuno residui che mima la regione ammino-terminale della proteina istonica, appartenente al complesso proteico nucleosoma. L’interazione tra Hp1beta e l’istone III porta all’impacchettamento del DNA in strutture terziarie e quaternarie, definite complessivamente eterocromatina. Dal momento che l’eterocromatina impedisce l'accesso dell’apparato di trascrizione al DNA, la sua formazione rappresenta un meccanismo di regolazione per inibire l'espressione genica in specifiche regioni del genoma. Il requisito fondamentale per studiare questa interazione mediante NMR, è l’assegnazione, utilizzando esperimenti tridimensionali eteronucleari, delle risonanze di 1H, 15N e 13C della catena polipeptidica della proteina Hp1beta. Ad oggi abbiamo completato l’assegnazione dei segnali relativi al dominio che media l’interazione con la proteina istonica III, definito “chromo-domain”. L'assegnazione dei segnali relativi alle altre due regioni della molecola, definiti “hinge-region” e “chromo-shadow domain”, è tuttora in corso. Abbiamo poi caratterizzato le proprietà di “tumbling” delle diverse regioni della proteina Hp1beta, mediante particolari esperimenti di rilassamento di magnetizzazione, definiti di “cross-correlation”. I valori di “residual dipolar coupling” sono stati utilizzati per confrontare la struttura del “chromo-domain” compreso nella proteina intera, con la struttura pubblicata dello stesso dominio prodotto come mutante di delezione. Tramite esperimenti di titolazione per risonanza magnetica nucleare abbiamo infine individuato i residui amminoacidici della proteina Hp1beta che sono coinvolti nel riconoscimento molecolare del peptide. I risultati dell’analisi delle differenze nei valori di “chemical shift”, ha consentito di mappare le regioni della proteina Hp1beta che sono coinvolte nell'interazione con la parte ammino-terminale dell'istone III.