Ruolo di TAK1 (TGF-beta activated kinase 1) nel processo di fibrogenesi nel corso della malattia di Crohn

Crohn's disease is a chronic inflammatory disease that can affect any segment of the intestinal tract, with a peak of incidence between 25 and 35 years of age affecting 2-7/100000 people per year. More than 33% of patients suffering from Crohn's disease develop intestinal stenosis, preferentially in the small intestine, within 10 years of diagnosis and the only treatment available is surgery. Recurrences occur in 75% of cases. The repairing process of an organ after a chronic damage, like Crohn's disease, is a delicate balance between the production of new extracellular matrix and destruction of the excess. When this balance is lost, the physiological process of repair leads to fibrosis characterized by overgrowth and scarring of tissue with the loss of normal functions. Sub-epithelial myofibroblasts are the main cells involved in deposition of extracellular matrix in the bowel and their role is now under investigation by many groups looking at several pathogenetic processes such as inflammation and cancer. TAK1 is a MAP3K activated by mitogen and inflammatory stimuli and involved in various intracellular signalling cascades. Among several cytokines able to activate TAK1 there is also TGF-?, a known profibrogenic cytokine, that shows high expression in the tissue affected by excessive fibrosis in Crohn's disease. Recently, the role of TAK1 has been associated with cardiac hypertrophy and renal fibrosis, this prompted us to investigate its role in the fibrogenic process in Crohn's disease. To study the involvement of TAK1 in fibrogenetic Crohn's disease we initially determined the expression levels and phosphorylation status of the protein in the ileal mucosa obtained from patients undergoing surgical resection for stenosis and in normal ileum specimens obtained from patients undergoing colectomy for cancer. The data obtained through western blotting analysis showed an increase in TAK1 expression in fibrotic tissue associated to an increased phosphorylation state, which characterizes its activation. Immunohistochemical studies, through co-localization with ?SMA, demonstrated a massive presence of myofibroblasts in the mucosa of patients with Crohn's disease, that expressed TAK1 and its phosphorylated form, mainly in the periglandular region. The functional characterization of TAK1 was therefore performed on primary ISEMFs extracted from regions of Crohn’s associated fibrosis and normal ileum. Cells derived from fibrotic tissues maintained the disease phenotype in vitro and showed higher levels of TAK1 expression and greater activated status compared to control cells. By immunocytochemical and western blotting studies we observed that TGF-? induced TAK1 phosphorylation in intestinal myofibroblasts. For this reason we started functional studies of gene silencing by RNA interference using an adenoviral vector. Collagen 1? mRNA was analyzed by Real Time PCR in ISEMF after TGF-? stimulus or silencing with the viral vector. The expression of collagen was higher in cells derived from Crohn’s disease specimens than in controls; however TGF-? induced more collagen expression in control cells. Tak1 silenced cells showed significantly reduced basal collagen expression and prevented TGF-?-induced collagen up-regulation. Using a TAK1 inhibitor we confirmed the data obtained with siRNA at both the RNA level and the protein level. In addition, myofibroblasts treated with TAK1 inhibitor or siRNA showed a reduced migratory capacity in a wound healing assay. To assess whether TAK1 can be used as an early marker of fibrogenetic process in Crohn's disease, we correlated its expression in a population of patients with Crohn's disease in remission and without clinical signs of stenosis, with markers of fibrosis. Preliminary data showed that the increased expression of Tak1 in Crohn’s mucosa correlated with the expression of two important fibrotic markers, collagen 1? and ?SMA. In conclusion, the results of this study support the role of TAK1 in intestinal myofibroblasts during the TGF-? -induced fibrogenesis process in Crohn’s disease and further studies might indicate whether it is a suitable therapeutic target as well as a prognostic tool.

Il morbo di Crohn è una malattia infiammatoria cronica che può colpire qualsiasi tratto dell’apparato digerente, con un picco di incidenza di 2-7/100000 abitanti per anno, nella fascia di età compresa tra i 25 ed i 35 anni. Più di un terzo dei pazienti colpiti da malattia di Crohn sviluppa stenosi intestinale, preferenzialmente al piccolo intestino, entro 10 anni dalla diagnosi e l’unico trattamento ad oggi efficace è l’asportazione chirurgica del tratto coinvolto con una frequenza di recidiva del 75%. La riparazione di un organo che subisce un danno cronico, come nel caso della malattia di Crohn, dipende dal delicato equilibrio fra la produzione di nuova matrice extracellulare e la distruzione di quella prodotta in eccesso. Quando questo equilibrio si perde la fisiologica riparazione sfocia nel processo fibrogenico caratterizzato dall’ispessimento ed indurimento di un tessuto, accompagnato dalla perdita delle sue normali funzioni. Le cellule che partecipano principalmente alla deposizione di matrice extracellulare nell’intestino sono i miofibroblasti subepiteliali (ISEMFs). TAK1 è una MAP3K attivata da mitogeni e stimoli infiammatori coinvolta in svariate cascate di segnale intracellulari. Tra le varie citochine in grado di attivarla vi è il TGF?, nota citochina profibrogenetica, i cui livelli di espressione sono aumentati nei segmenti intestinali sede di fibrosi del morbo di Crohn. Recentemente il ruolo di TAK1 è stato associato allo sviluppo dell’ipertrofia cardiaca e della fibrosi renale. Per tali ragioni abbiamo voluto investigare il suo ruolo nella fibrosi del morbo di Crohn. Per studiare il coinvolgimento di TAK1 nel processo fibrogenetico della malattia di Crohn ne è stata paragonata l’espressione e lo stato di fosforilazione nella mucosa ileale ottenuta da pazienti con malattia di Crohn, sottoposti a resezione chirurgica per stenosi, rispetto a segmenti di ileo sano ricavato da pazienti sottoposti a colectomia per cancro. I dati ottenuti mediante analisi di western blotting hanno mostrato un aumento dell’espressione di TAK1 in corso di fibrosi accompagnata dalla maggiore fosforilazione della chinasi che ne dimostra l’attivazione. Studi di immunoistochimica hanno permesso, mediante co-localizzazione con ?SMA, di osservare la distribuzione di TAK1 nel tessuto e la sua preponderante espressione in miofibroblasti subepiteliali. Difatti, come atteso, la mucosa derivata dai pazienti con malattia di Crohn ha mostrato una abbondante presenza di miofibroblasti. L’abbondanza dell’espressione dell’?SMA nella mucosa di Crohn è stata inoltre osservata mediante analisi di western blottin (figura 5.1C). L’espressione di TAK1 e della sua forma fosforilata è stata osservata soprattutto nella regione perighiandolare, in corrispondenza dei miofibroblasti, e aumentata nei segmenti fibrotici. La caratterizzazione di TAK1 è stata dunque effettuata su miofibroblasti primari estratti da mucosa fibrotica di Crohn e tessuto controllo. Cellule derivate da tessuto fibroso hanno mostrato maggiori livelli di espressione proteica di TAK1 ed un maggiore stato di attivazione rispetto a cellule controllo. Studi di immunoistochimica e western blotting hanno permesso di osservare che il TGF? in grado di attivare TAK1 nei miofibroblasti intestinali. Per questo motivo abbiamo intrapreso degli studi funzionali di silenziamento genico mediante RNA interference utilizzando un vettore adenovirale per trasdurre miofibroblasti intestinali. Abbiamo analizzato il trascritto del collagene 1?, come marcatore della produzione di matrice extracellulare, mediante Real Time PCR in cellule isolate da pazienti con morbo di Crohn e controllo, stimolate con TGF?. L’espressione del collagene è risultata aumentata in cellule di Crohn rispetto ai controlli, e lo stimolo con il TGF? ne ha stimolato in maniera significativa l’espressione solo in cellule controllo. Il silenziamento di Tak1 ha inibito l’incremento del collagene 1? indotto dal TGF? ed ha ridotto l’espressione in cellule di Crohn a valori paragonabili ai controlli. L’uso di un inibitore di TAK1 ha confermato ed esteso, grazie al saggio dell’incorporazione di 3H prolina, i dati ottenuti nella valutazione dell’espressione del collagene 1? a livello genico anche a livello di proteine. Inoltre. In saggi di wound healing i miofibroblasti trattati con l’inibitore di TAK1 hanno mostrato una ridotta mobilità. Infine, per valutare se TAK1 possa essere considerato un marker precoce del processo fibrogenetico nella malattia di Crohn, abbiamo paragonato la sua espressione, correlandola a marcatori della fibrosi, in una popolazione di pazienti con morbo di Crohn, in fase di remissione e senza manifestazioni cliniche di stenosi, con soggetti sani e con colite ulcerosa. I dati preliminari da noi ottenuti hanno mostrato un aumento dell’espressione di Tak1 nella mucosa di Crohn rispetto ai controlli e tale espressione correlava con l’espressione del collagene 1? e di ?SMA. In conclusione i risultati che abbiamo ottenuto supportano un ruolo centrale di TAK1 nella attivazione dei miofibroblasti intestinali indotta dal TGF? in corso di malattia di Crohn e pertanto questa chinasi potrebbe rappresentare un marcatore precoce della evoluzione in senso fibrotico della malattia che un potenziale target terapeutico.