Two Complementary Strategies to Inhibit the Hiv-1 Nucleocapsid Protein

This thesis work is devoted to the study of potential antiviral drugs to fight the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). HIV-1 is responsible for the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), which represents a global concern affecting more than thirty-five million people worldwide. Since the discovery of the aetiological agent of AIDS in the mid-eighties, the pharmacological therapy had to deal with drug-resistant virus strains that are naturally selected by the available drugs as consequence of the inherent genetic variability of HIV-1. The current therapeutic approach, which focuses on the inhibition of key viral enzymes, must therefore employ concomitant administration of multiple drugs in order to suppress efficiently the infection. However, the high costs and the low compliance of these pharmacologic regimes represent major hurdles to the effectiveness of the therapy. In the past years, novel strategies able to interfere with non-canonical viral targets or host proteins have been proposed as possible venues toward the development of valuable drug candidates. In this context, we focused on the HIV-1 nucleocapsid (NC), a small protein characterized by a cationic character and zinc fingers (ZFs) that confer nucleic acid chaperone properties. This protein is involved in many steps during the virus replication cycle, from the early reverse transcription to the late particle formation processes. In addition, NC functions rely on the strikingly conserved ZFs structure that has been observed to hardly mutate, differently from the validated drug targets exploited thus far. Therefore, NC represents a promising and novel pharmacological target to fight HIV-1, avoiding the problem of drug resistance. Pursuing the discovery of inhibitors of the NC nucleic acid chaperone properties, in this research work we followed two complementary strategies. A direct approach aimed to the development of small molecules interacting with the ZFs domain of NC whereas an indirect approach employed binders of the nucleic acid substrates of NC. In the former approach, we studied the activity and mechanism of action of novel compounds able to bind NC, highlighting interesting hits that set the bases for the further development of this class of inhibitors. Series of 2,6-dipeptidyl-anthraquinone conjugates (AQs) were instead studied as intercalating agents able to freeze the dynamics of important viral nucleic acid structures and, in the process, inhibit indirectly the biological functions of NC. AQs have been extensively studied in our laboratory; my research activity contributed to explore the effect of the side chain orientation on the NC inhibitory activity observed for these compounds. In addition, we investigated the interaction of AQs with novel viral RNA substrates, in order to prove the pleiotropic inhibitory effect exerted by these compounds on multiple steps of the virus replication cycle. Altogether, the results achieved led us to propose a novel approach for the development of inhibitors of NC, which we think might represent a leap forward in the development of this potential therapeutic class to actual drugs.

Questo lavoro di tesi è dedicato allo studio di potenziali farmaci antivirali per combattere il virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). HIV-1 è responsabile dell’omonima sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), un problema di ordine globale che interessa più di trentacinque milioni di persone in tutto il mondo. A partire dalla scoperta dell'agente eziologico dell'AIDS avvenuta alla metà degli anni ottanta, la terapia contro HIV-1 ha dovuto confrontarsi con virus farmaco-resistenti selezionate dai farmaci disponbili come conseguenza della variabilità genetica intrinseca di HIV-1. L'approccio farmacologico, che si concentra sull'inibizione di specifici enzimi virali, impiega la concomitante somministrazione di molteplici farmaci al fine di controllare efficacemente l’infezione. Tuttavia, i costi elevati e la scarsa compliance di questi regimi farmacologici rappresentano i maggiori ostacoli all'efficacia della terapia. Negli ultimi anni sono state proposte nuove possibili strade verso lo sviluppo di candidati farmaci promettenti, in grado di interferire con bersagli virali non-canonici o proteine della cellula ospite. In questo contesto, ci siamo concentrati su nucleocapside (NC) di HIV-1, una piccola proteina cationica caratterizzata da due zinc fingers (ZFs) che conferiscono proprietà chaperoniche su acidi nucleici. Questa proteina è coinvolta in diversi punti del ciclo replicatvo del virus, a partire dalla retrotrascrizione fino al processo di formazione delle particelle virali. Inoltre, le funzioni di NC si basano sulle strutture ZFs che risultano altamente conservate e non tollerano mutazioni, diversamente dai bersagli canonici dei farmaci finora utilizzati. Pertanto, NC rappresenta un promettente e nuovo bersaglio farmacologico per combattere HIV-1, evitsndo così il problema della farmacoresistenza. Con l’obbiettivo di scoprire nuovi inibitori delle proprietà chaperoniche di NC, in questo lavoro di ricerca abbiamo seguito due strategie complementari. Un approccio diretto è stato finalizzato allo sviluppo di piccole molecole interagenti con il dominio ZFs di NC, mentre un approccio indiretto impiegava leganti di acidi nucleici che sono substrati di questa proteina. Considerando l’appproccio diretto, abbiamo studiato l'attività e il meccanismo d'azione di nuovi composti in grado di legare NC, evidenziando interessanti molecole che possono rappresentare una nuova classe di inhibitori di NC con ulteriori potenzialità di sviluppo. Serie di coniugati 2,6-dipetidil-antraquinonici (AQs) sono stati invece studiati come agenti intercalanti in grado di bloccare la strutture di sequenze acidi nucleici virali e, in questo modo, inibire indirettamente le funzioni biologiche di NC. Gli AQs sono stati ampiamente studiati nel nostro laboratorio; la mia attività di ricerca ha contribuito ad esplorare le relazioni struttura-attività per l’inibizione di NC. Inoltre, l'interazione digli AQs con nuovi RNA virali è stata studiata al fine di dimostrare l'effetto inibitorio pleiotropico esercitato da questi composti su diverse fasi del ciclo di replicazione del virus. Complessivamente, i risultati raggiunti ci hanno portato a proporre un nuovo approccio per lo sviluppo di inibitori di NC, che pensiamo possa rappresentare un contributo allo sviluppo di questa potenziale classe terapeutica.